光照节律改变对大鼠视网膜的影响及中药干预作用的研究

徐金华 王育良 林 琳 柏玉洁

“天人相应”是中医认识人体的理论基础，认为机体的阴阳盛衰与日、地、月运行息息相关。近年来生物学研究证实生物体内存在生物钟，调控着机体生命活动和生理功能，与日、地、月运行的周期相适应。现代环境医学亦揭示自然环境变化可通过调控生物钟影响人的生理功能等，强调了人的生理病理状态与自然环境如昼夜交替、季节交替等密切相关，其中最为关键的自然环境变化是昼夜的长短，即光照节律的变化〔1〕。本文主要研究光照节律改变对大鼠视网膜结构和功能的影响，以及中药的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及设备：健康无眼病SD大鼠（上海斯莱克实验动物有限责任公司提供），鼠龄3周，雌性，75～85 g，均为清洁级动物。普通家庭用36 W日光灯（菲利普照明公司）1个，定时调控开关（上海石泰电器有限公司）1个。自制光照控制箱，规格2.0 m×0.6 m×1.2 m（长×宽×高），箱顶安装36 W日光灯管1只，箱体外装一个定时调控开关。罗兰RETIPort眼科电生理检查仪（德国），电生理不锈钢针形电极。丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.1.2 实验用药：中药补阴方由当归10 g、白芍10 g、熟地黄 10 g、山茱萸 10 g、菟丝子12 g、山药15 g组成，补阳方由熟地黄10 g、续断15 g、淫羊藿10 g、丹参10 g、巴戟天10 g组成。

1.2 分组与给药

1.2.1 实验分组：健康SD大鼠45只，随机分成3组，即对照组、模型组、中药组，每组15只。对照组饲养在正常昼夜交替节律的环境中，接受自然光线照射，模型组饲养在光照控制箱内，接受人工光源照射。中药组饲养在光照控制箱内，接受人工光源照射，大鼠性成熟后予以中药灌胃。大鼠在箱内可自由饮水和进食，箱内温度与室温同，定时调控开关自动控制箱内照明时间，我们设定每日光照“明”（早06∶00至晚24∶00）、“暗”（晚 24∶00 至早 06∶00） 循环交替时间为18 h/6 h，观察时间为4个月。

1.2.2 中药组给药方法：SD大鼠性成熟后，阴道分泌物涂片确定动情周期，动情周期前半期补阴方灌胃，动情周期后半期补阳方灌胃，给药时间至实验结束，SD大鼠用药剂量按成人临床用量经折算后的剂量〔2〕进行灌胃。

1.3 检查方法

1.3.1 视觉电生理检查：实验至4个月时，各组大鼠进行眼电生理检查。（1）闪光视网膜电图（flash electroretinogram，F-ERG）测试：采用不锈钢针形电极，记录电极安置在角膜缘，电极尽量与角膜产生最大接触，参考电极插入耳缘部皮下，地电极插入尾部。记录国际临床视觉电生理学会（International Society for Clinical Electrophysiology of Vision，ISCEV）建议的标准 5 项：暗视视杆反应（rod response，Rod-R）、最大混合反应（maximal combined response，Max-R）、振荡电位（oscillatory potentials，OPs）、明视视锥反应（coneresponse，Cone-R）、30Hz闪烁光（30HzFlicker）。

1.3.2 病理组织学观察：实验4个月时，每组随机取受试大鼠10只，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（50 mg/kg），颞侧3点（或9点）位角巩膜缘缝线标记，颈脱臼法处死大鼠，随机摘除一侧眼球，保留部分视神经，常规固定，石腊包埋，通过视神经及标记线经线方向连续切片，HE染色，光学显微镜下观察SD大鼠视网膜病理变化。

1.3.3 视网膜过氧化物及抗氧化酶活性测定：实验4个月时，每组选取受试大鼠5只，戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，颈脱臼法处死大鼠，迅速摘除双侧眼球，手术显微镜下剥离视网膜，加入生理盐水300μl，在冰浴中手动匀浆5 min，2500 r/min离心 10 min，取匀浆上清，再用生理盐水1∶4稀释待测。硫代巴比妥酸法测定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，羟胺法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，考马斯亮蓝法测定蛋白质含量。

1.4 统计学处理

2 结果

2.1 视觉电生理检查

对照组大鼠引出的F-ERG波形较为典型、分化好，模型组引出的F-ERG波形不典型，主要表现为振幅降低，其中Max-R a、b波振幅显著下降，下降幅度分别为 54.3%、65.4%；Cone-R a、b波振幅下降，幅度分别为35.8%、38.5%；Ops OP2波振幅（OS2值）、30Hz闪烁光N1-P1振幅下降，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。中药组大鼠所引出的FERG波形与模型组相似，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05），中药组 Max-R b波较模型组增高， 差异有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

表1 各组大鼠F-ERG振幅比较（，μV）

表1 各组大鼠F-ERG振幅比较（，μV）

注：与对照组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＞0.05，③P＜0.05（独立样本 t检验）

Rod-R Max-R a波 a波对照组 17.25±4.12 94.47±5.21模型组 10.29±2.98① 43.81±4.65①中药组 13.24±4.13①② 51.17±2.86①②组别b波b波b波45.86±3.9642.67±4.35①39.87±6.31①②256.39±6.3293.25±3.32①124.25±2.82①③Cone-R a波9.34±5.236.24±5.15①6.71±3.15①②52.73±3.8732.25±3.59①39.29±2.91①②Ops OS2 30Hz Flicker N1-P1 90.42±3.87 23.38±4.3467.47±5.03① 8.48±3.54①66.46±5.27①② 10.08±3.14①②

2.2 病理组织学观察

HE染色光学显微镜观察：对照组视网膜各层间分界清晰，内、外核层细胞核密集，胞核排列整齐规则，内、外丛状层疏松呈网状，神经节细胞核大，淡染（图1A）。模型组视网膜普遍萎缩变薄，层次不清，层数减少，排列紊乱（图1B）。中药组与模型组相似（图1C）。

图1 各组SD大鼠视网膜光学显微镜像（HE ×40）。 1A.对照组：视网膜各层分界清晰，内、外核层排列整齐。1B.模型组：视网膜萎缩变薄，层数减少，排列紊乱。1C.中药组：视网膜萎缩变薄，层数减少，排列紊乱

2.3 视网膜过氧化物以及抗氧化酶活性分析

对照组大鼠视网膜MDA含量低，SOD活性高，与模型组及中药组比较差异有统计学意义（P＜0.05），中药组 SOD活性比模型组高，差异有统计学意义（P＜0.05），MDA含量比模型组低，但差异无统计学意义（P＞0.05）（表 2）。

表2 各组大鼠视网膜MDA、SOD浓度比较（）

表2 各组大鼠视网膜MDA、SOD浓度比较（）

注：MDA浓度：对照组与模型组比较t=23.63，P=0.000；对照组与中药组比较t=15.41，P=0.01；中药组与模型组比较t=2.34，P=0.102。SOD浓度：对照组与模型组比较t=38.97，P=0.000；对照组与中药组比较t=12.01，P=0.001；中药组与模型组比较t=4.39；P=0.022。MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶

组别 MDA浓度/（nmol/mg蛋白） SOD浓度/（U/mg蛋白）对照组 0.785±6.37 114.325±4.25模型组 2.556±7.15 60.554±5.88中药组 2.037±6.73 73.317±7.19

3 讨论

光照环境的改变对生物节律的影响是目前生命科学研究的热点〔2〕，生物节律是生物体重要的生命活动，调控着机体生理病理变化，多项动物实验表明干扰了动物的生物钟可造成多种损害，而人为调整恢复生物节律可有效地减轻或抵消生物钟改变带来的主体节律紊乱的不利影响。国外调整生物节律的对策主要是休息，进行强制光照，或将人分成晨间型和夜间型来安排不同时间的工作。中医学强调天人相应论，中医药在调整生物节律方面有西医无法替代的优势。

我院通过长期的临床和实验研究总结出调整节律的有效方法，即中医的阴阳序贯法，该方法已获取专利，此法源于著名老中医夏桂成教授半个世纪的临床经验，又经谈勇教授课题组的深入研究，已形成我院特色疗法之一。夏桂成教授立足于“天人相应”观点，认为人体生物钟节律是依据日、月节律运动而变化的，并且以日节律为基本单位，人体内阴阳随十二个时辰的变更消长转化，继而扩至月节律，日节律的紊乱可影响月节律，引起生殖周期节律紊乱〔3〕。借鉴这一观点，王育良教授在实验中药组采用阴阳序贯法，意在通过调整大鼠生殖内分泌节律，来调整大鼠的生命主节律，从而减轻或抵消生物钟改变带来的不利影响，使机体生理功能稳定。

ERG是评价视网膜功能的客观检查方法，广泛应用于各种视网膜损害疾病的临床和科学研究。ISCEV建议的标准5项检查从不同层面反映视网膜功能，对视网膜疾病的定位诊断具有重要的临床意义，此方案也适用于动物实验研究。Takahashi T等〔4〕报道54只SD大鼠持续光照24 h和48 h，2周后行ERG检查，结果显示Rod-R a、b波振幅，Cone-R b波振幅降低，提示光照可能主要通过损害视锥细胞使视网膜功能下降。本研究中，模型组及中药组与对照组比较 Max-R a、b波振幅显著下降，Cone-R a、b波振幅下降，Ops OS2值、30Hz闪烁光N1-P1振幅下降。已知Max-R a波起源于视网膜光感受器和色素上皮细胞，b波起源于视网膜内层；Cone-R起源于视网膜锥体系统；OPs起源于视网膜无长突细胞及视网膜神经节细胞突触电位；30Hz闪烁光起源于视网膜锥体系统，表明视网膜视锥细胞及视网膜内层功能受损伤。本实验视觉电生理结果及病理组织学结果与Takahashi T等报道较为一致，可见光是引起视网膜光损伤的主要原因之一。其损伤机制主要有热损伤、机械损伤和光化学损伤等，其中光化学损伤是最常见的类型，这种损伤的实质是由组织的生物化学和分子生物学变化引起的。我们在结果中还发现中药组Max-R b波比模型组显著增高，b波起源于视网膜内层，与视网膜双极细胞和Müller细胞的电活动有关，考虑中药可能对视网膜内层有一定的保护作用，但尚需通过大样本资料深入研究加以证实。

抗氧化物酶SOD可清除体内自由基，因而SOD活性的高低间接反映了机体清除氧自由基的能力。视网膜丙二醛（MDA）的量常可反映其脂质过氧化的程度，同时也反应了细胞受自由基攻击的严重程度。SOD是视网膜抗氧化系统的主要成份，它可催化超氧化物发生歧化反应生成性质稳定的无毒物质，对于视网膜抵御活性氧分子的氧化攻击，避免结构损伤，具有重要的意义〔5〕。在实验中我们发现中药组与模型组比较SOD活性高，差异有统计学意义，这或许提示中药通过提高SOD活性，增强了视网膜抵御活性氧分子的氧化攻击的能力，从而保护视网膜内层，稳定视网膜双极细胞和Müller细胞的电活动。但中药组视网膜光镜观察与模型组相似，故我们推论光照节律改变可能对视网膜的发育有一定的影响，在大鼠性成熟前我们未予以药物治疗，光照节律改变对视网膜已造成不可逆的损伤，性成熟后予以药物治疗也只能在一定程度上起到保护作用，所以我们认为若根据夏桂成教授调整日节律理论，在光损伤的早期用药，可能效果更好。中药是否如上述所示对视网膜有保护作用，其作用位点、作用机制如何，尚需通过大样本实验进一步深入研究加以证实。

[1]刘晓燕，郭霞珍，许筱颖，等.反季节光照模拟对大鼠血清褪黑素及性腺轴激素的影响[J].中华中医药学刊，2009，27（1）：69-71.

[2]Pauley SM.Lighting for the human circadian clock：recent research indicates that lighting has become a public health issue[J].Med Hypotheses，2004，63（4）：588-596.

[3]夏桂成.我对子午流注阴阳盛衰转换的认识[J].南京中医药大学学报，2003，19（7）：204-206.

[4]Takahashi T，Machida S，Masuda T，et al.Functional changes in rod and cone pathways after photoreceptor loss in light-damaged rats[J].Curr Eye Res， 2005， 30（8）： 703-713.

[5]张 震，张效房.视网膜光损伤机制中NOS作用的实验研究[J].眼外伤职业眼病杂志，2005，27（4）：246-248.