多指标正交实验优选旋覆代赭汤最佳煎煮工艺

2012-07-26秦昆明姚仲青蔡宝昌

中成药 2012年11期

汪斌，秦昆明，2，姚仲青，蔡宝昌，2*

(1.南京海昌中药集团有限公司，江苏南京210061;2.南京中医药大学，江苏南京210029)

旋覆代赭汤出自东汉张仲景的《伤寒杂病论》，是中医临床常用汤剂之一，广泛用于治疗反流性食管炎［1-2］、胆汁反流性胃炎［3-4］、顽固性呃逆［5］等疾病。原方由旋覆花、人参、代赭石、甘草、半夏、大枣、生姜七味药组成，本方临床运用历史悠久，疗效确切，现代药理学研究表明，旋覆代赭汤中旋覆花、代赭石和大枣对大鼠胃底条肌收缩具有显著促进作用，旋覆花与甘草、大枣分别合用，有明显协同促进作用［6］。另有文献显示旋覆花中绿原酸能显著增加大鼠消化道的蠕动，提高平滑肌张力，人参和甘草对实验性胃溃疡有一定的治疗和预防作用，松弛胃肠道平滑肌，减少胃酸分泌［7］。于强，刘彬等研究发现旋覆代赭汤可以显著提高血浆胃动素水平，促进胃排空，防治酸反流，进而达到临床对功能性消化不良症治疗的目的［8-9］。但是，方剂临床疗效的发挥与方剂的煎煮工艺密切相关，目前尚没有报道对旋覆代赭汤的煎煮工艺进行系统的研究。本实验对旋覆代赭汤的煎煮工艺进行了系统研究，采用双波长高效液相色谱法，建立同时测定旋覆代赭汤中5种主要成分绿原酸、甘草酸和人参皂苷 Rg1、Re、Rb1的测定方法，并通过正交实验设计优化煎煮工艺，为临床煎煮旋覆代赭汤的规范化提供合理的依据。

1 实验器材

1.1 仪器日本岛津LC—20AB高效液相色谱仪系统，RE—52型旋转蒸发仪，KQ5200DB型数控超声仪，80—2型台式低速离心机。

1.2 药品与试剂绿原酸标准品 (批号:110753-200413)，甘草酸铵标准品 (批号:110731-200615)，人参皂苷 Rg1标准品 (批号:110703-200726)，人参皂苷 Re标准品 (批号:110754-200822)，均购自中国药品生物制品检定所;人参皂苷Rb1标准品 (批号:11072432)，购自上海同田生物制品有限公司;旋覆花、代赭石、人参、甘草等中药饮片由南京海源中药饮片有限公司提供，并经南京海昌中药集团有限公司刘逊硕士鉴定。乙腈 (色谱级)，纯净水，其余试剂均为分析级。

2 方法与结果

2.1 正交实验设计根据传统的汤剂煎煮方法和前期预实验结果，选用浸泡时间、加水量、煎煮时间、煎煮次数作为考察因素，并确定各因素水平，以旋覆代赭汤中绿原酸、甘草酸和人参皂苷Rg1、Re、Rb1及汤剂浸出物得率为指标，采用L9(34)正交实验表安排实验，其因素水平见表1。

2.2 汤剂溶液制备按旋覆汤处方称取旋覆花9 g、甘草6 g、人参6 g、代赭石9 g、半夏9 g、干姜10 g、大枣4枚，于煎药砂锅中，按L9(34)正交实验表所列条件进行煎煮，滤过，合并滤液，加水定容至2000 mL量瓶中，摇匀，即得汤剂溶液。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

2.3 各指标成分的定量测定

2.3.1 色谱条件 YMC-Pack ODS-A C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流动相为0.1%磷酸水溶液 (A)和乙腈溶液 (B)，梯度洗脱 (0～10 min，5% ～10%B;10～28min，10% ～15%B;28～58 min，15% ～18%B;58～75 min，18% ～25%B;75～125 min，25% ～50%B);体积流量1.0 mL/min;检测波长为203 nm和254 nm;柱温35℃;进样量10 μL，结果见图1和图2，绿原酸、人参皂苷Rg1、Re、Rb1和甘草酸铵色谱峰保留时间分别为21.1，81.9，82.4，101.7，110.3 min。

图1 混和对照品HPLC图谱(A.254 nm B.203 nm)Fig.1 HPLC in mixed standards(A.254 nm B.203 nm)

图2 旋覆代赭汤的HPLC图谱 (C.254 nm D.203 nm)Fig.2 HPLC in Xuanfu Daizhe Decoction samples(C.254 nm D.203 nm)

2.3.2 对照品溶液制备精密称取干燥至恒定质量的绿原酸、甘草酸铵、人参皂苷Rg1、Re、Rb1对照品适量，加甲醇适量溶解，定容至10 mL量瓶中，配制成含绿原酸0.591 mg/mL、甘草酸铵0.221 mg/mL(折合甘草酸为 0.2165 mg/mL［10］)、人参皂苷Rg10.513、Re 0.515、Rb10.660 mg/mL的混标溶液，4℃存放备用。

2.3.3 标准曲线绘制分别精密移取上述混标溶液适量，加甲醇溶解，稀释制成不同浓度的混标溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，各精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录各标准品峰面积。以各标准品进样量为横坐标，峰面积值为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表2，均显示线性关系良好。

表2 5种标准对照品的线性回归方程Tab.2 Linear equation of five analytes

2.3.4 供试品溶液制备及测定精密移取2.2项下汤剂溶液100 mL，旋转蒸发仪蒸去水溶液，残渣用80%甲醇超声提取30 min，提取液3000 r/min离心10 min，取上清液，80%甲醇定容至10 mL量瓶中，作为供试品溶液。0.45 μm微孔滤膜滤过，精密吸取10 μL注入液相色谱仪，记录峰面积值，计算各指标成分质量分数，结果见表3。

表3 正交实验结果Tab.3 Result of orthogonal design assay

2.3.5 精密度实验取对照品溶液，按样品测定的方法，重复测定5次，记录峰面积值，结果各指标成分的RSD值均小于5.0%，表明本法精密度良好。

2.3.6 重复性实验取同一批号的处方药材样品6份，按供试品溶液制备的方法操作，并进样分析，计算各指标成分含量的RSD值，均小于5.0%，说明本方法重复性良好。

2.3.7 回收率实验取已知5种指标成分的旋覆代赭汤样品溶液5份，分别准确加入适量混合对照品溶液 (含绿原酸0.591 mg/mL、人参皂苷Rg10.513 mg/mL、Re 0.515 mg/mL、Rb10.660 mg/mL、甘草酸铵0.221 mg/mL)，按制备供试品溶液的方法制备加样回收供试品溶液，HPLC法测定各成分，计算得绿原酸、人参皂苷Rg1、Re、Rb1、甘草酸平均回收率分别为97.60%、97.95%、98.42%、97.90%、97.31%，其RSD值均小于5.0%。

2.3.8 稳定性实验取同一供试品溶液，分别于0、2.5、5、7.5、10、24 h进样6次，结果24 h内各指标成分峰面积的RSD值均小于5.0%，表明24 h供试品溶液稳定性良好。

2.4 正交实验结果分析由于本次实验同时对旋覆汤的5个有效成分进行分析，故结合其浸出物得率，采用综合加权评分法，5个成分的权重系数均为0.15，浸出物得率的权重系数为0.25，见表3。分别把6个成分项中最好的指标定为100分，其它各实验项按下式评分:

对所得实验结果进行直观分析和方差分析，结果见表3和表4。从表3的结果可以看出，各因素的主次顺序为D＞B＞C＞A，因素A的极差最小，故将此列作为方差分析的误差列，由表4可知，因素B和D对实验结果有显著影响 (P＜0.01)，因素A和C对实验结果均无显著影响 (P＞0.05)，经过综合分析，确定旋覆代赭汤最佳煎煮工艺为A2B3C1D3。

表4 方差分析Tab.4 Analysis of variance

2.5 最佳煎煮工艺验证取3份处方药材，按照已确定的最佳煎煮工艺煎煮，测得浸出物平均得率为 (25.857±1.66)%，汤剂中绿原酸，人参皂苷 Rg1、Re、Rb1以及甘草酸的质量分数，结果见表5。

3 讨论

旋覆代赭汤是中医临床治疗胃气受损、心下痞哽、噫气不除等症的常用汤剂，但因复方成分复杂，其煎煮方法的科学与否会直接影响到临床疗效，多指标优选中药复方汤剂煎煮工艺，是提高中药汤剂质量的重要手段，能更合理、更全面的评价整个煎煮过程［11-12］，故本研究通过正交实验设计，采用多指标综合评分，得到的旋覆代赭汤最佳煎煮方案为:处方药材加水10倍量，浸泡15 min，煎煮3次，每次煎煮30 min，后合并滤液。经验证，该煎煮方法稳定可行，能有效控制旋覆代赭汤的质量。

表5 最佳工艺验证 (±s，n=3)Tab.5 Validation of best process(±s，n=3)