Box-Behnken效应面法优化贯叶金丝桃中金丝桃苷的提取工艺

柯仲成， 程子洋， 陈 龙

(黄山学院化学系制药工程教研室，安徽黄山245041)

贯叶金丝桃是藤黄科植物贯叶金丝桃Hypericum perforatum.L的地上干燥部分，具有清热利湿、舒肝解郁等功效。药理研究表明，其含有的总黄酮成分具有抗抑郁、抗乙肝病毒作用和利胆作用［1-2］，金丝桃苷效果最好。文献报导中，大多是采用正交设计实验对金丝桃苷提取工艺进行考察［3-4］。考虑正交设计的局限性，本实验通过 Box-Behnken效应面法［5-8］考察贯叶金丝桃中金丝桃苷的影响因素，优化确定提取工艺。

1 仪器和试剂

岛津LC-10A高效液相色谱仪 (日本)，色谱柱Alltima C18(5 μm，4.0 mm×250 mm)，BT25S电子天平 (赛多利斯)，圆底烧瓶 (安徽玉珠玻璃仪器有限公司)。

金丝桃苷对照品 (购于中国药品生物制品检定所，批号111521-200603)，贯叶金丝桃购自黄山龙源药业有限公司，经安徽中医学院药学院潘鲁敏副教授鉴定为藤黄科植物贯叶金丝桃;乙醇购自黄山酒精厂;其他试剂均为色谱纯、分析纯;重蒸馏水自制。

2 方法与结果

2.1 金丝桃苷测定方法的建立

2.1.1 色谱条件［9］流动相为水-乙腈-磷酸 (825∶175∶1)，体积流量1.0 mL/min，检测波长360 nm，进样量20 μL，Alltima C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm)色谱柱柱温为40℃。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取5.2 mg金丝桃苷对照品，用适量70%甲醇溶解，再定容于25 mL量瓶中，制成0.208 mg/mL对照品贮备液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取贯叶金丝桃适量，碎成粗粉，用70%乙醇加热回流提取，过滤，回收乙醇，加沸水溶解，冷却，过滤，浓缩，干燥的提取物，加适量70%甲醇溶解，过滤，定容至50 mL量瓶中，制成供试品溶液。

2.1.4 标准曲线的绘制 精密吸取金丝桃苷对照品贮备液0.5、1、2、3、4 mL，分别用70%甲醇定容至10 mL，配制得一系列对照品溶液，分别测定。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程Y=172352X+10145(r=0.9984)，说明金丝桃苷在104～832 μg范围内具有较好的线性关系。

2.1.5 稳定性试验 取同一份供试品溶液，分别于0、1、2、4、8、24 h进样，测定峰面积，RSD为1.58%，说明在24h内样品溶液稳定。

2.1.6 精密度试验 取同一份供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积，RSD为1.78%，说明仪器的精密度良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批贯叶金丝桃样品6份，按2.1.3项下方法制备供试品溶液测定，测得贯叶金丝桃中金丝桃苷平均质量分数为7.04 mg/g，RSD为1.49%，说明具有良好的重复性。

2.1.8 加样回收率实验 精密称取贯叶金丝桃粗粉10.0 g，平行6份，加入金丝桃苷对照品溶液4 mL(金丝桃苷质量浓度20.8 μg/mL)，用70%甲醇溶解，过滤，定容至10mL量瓶中，HPLC测定，计算得金丝桃苷平均回收率 (n=5)98.27%，RSD为1.77%。

2.1.9 样品测定 取供试品溶液，HPLC测定，见图1，图2。根据其峰面积，计算金丝桃苷的提取率。

图1 金丝桃苷对照品HPLC色谱图

图2 供试品溶液HPLC色谱图

金丝桃苷提取率 (Y)=提取液中金丝桃苷量 /原药材中金丝桃苷量×100%

2.2 贯叶金丝桃中金丝桃苷提取工艺优化

2.2.1 实验设计及结果 通过文献［3，10］和预试验，得出影响贯叶金丝桃回流提取的主要因素有:溶剂用量、乙醇体积分数、提取时间及提取次数等。考虑到提取次数为非连续变量因素，回归处理较为繁琐，故根据实际情况，将其固定为2。依据星点设计的研究思路，将每个因素设置3水平，用代码值-1、0、1来表示。代码值所代表的实际值见表1，实验设计与结果见表2。

表1 考察因素与水平的编码与实际值

表2 Box-Behnken实验设计与结果

2.2.2 二项式方程数学模型拟合 将实验所得数据，利用软件 (Design-Expert 7.1.3)进行效应面分析，以金丝桃苷提取率 (Y)为效应值，对各因素 (X1、X2、X3)分别进行二项式方程拟合和多元线性回归，得回归方程如下:

二项式方程拟合:Y=71.08+1.37X1+2.20X2+1.26X3－0.78X1X2+0.36X1X3－0.20X2X3－0.17－

多元线性回归:Y=70.15+1.37X1+2.20X2+1.26X3(R2=0.8307)

比较R2大小，发现二项式方程拟合较为理想，删除其中t检验不显著项，将二项式方程简化为:

从方差分析结果 (见表3)可知，乙醇体积分数、液料比、提取时间3个因素对金丝桃苷提取率都有极显著影响;乙醇体积分数和液料比的相互作用具有显著影响，含乙醇体积分数和提取时间、料液比和提取时间的相互作用没有显著影响;回归方程失拟检验不显著，说明影响提取的其他一些未知因素对试验干扰比较小。因此，该方程较好地描述了金丝桃苷提取率随各个因素的变化规律，具有良好的预测指导性。

表3 方差分析

2.2.3 提取工艺参数优化和预测 依据二次多项式数学模型，应用Design-Expert 7.1.3软件，绘制金丝桃苷提取率(Y)与相互作用较显著的两个自变量 (X1、X2)的三维效应曲面图 (X3=2)及等高曲线。利用回归模型进行分析，预测金丝桃苷提取率的最大值为73.17%，最优提取工艺条件为:11.0倍量的77.6%乙醇，提取2次，每次2.7 h。

2.2.4 验证实验 根据预测得出的最优提取工艺条件，进行验证实验。为了方便工业化生产，将提取工艺参数设为整数，为11.0倍量的78%乙醇，提取2次，每次3 h，平行3次。金丝桃苷的提取率分别为71.77%、71.94%、70.15%，平均值为71.29%，RSD为1.39%。说明所建立的数学模型具有精确的预测性，所选工艺条件具有良好的重现性。

3 讨论

传统中药的提取工艺研究中，多采用的是正交设计试验，虽然也可以取得较好的效果，但由于其是采用线性数学模型进行拟合，因而经常无法精确找到最佳点。本实验采用非线性数学模型Box-Behnken效应面法进行拟合，可以充分考虑了各因素之间的交互作用，提高了实验准确性和预测指导性，将更好地促进贯叶金丝桃中金丝桃苷的开发利用。

效应面优化法在药物制剂［11-13］中应用较为广泛，近年来，在传统药物的研究也逐渐深入，但还没有很好地应用于现代中药行业中。本研究采用Box-Behnken效应面法对传统药材的提取工艺进行了考察，并进行验证实验，为其进一步应用于中药产业提供科学、合理的实验依据。

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