T-SPOT.TB在结核病诊断中的应用价值

刘国威 梅早仙 杜钟珍

据世界卫生组织估算，全世界有1/3人口感染了结核分枝杆菌，每年有900万新增结核病患者，约300万人死于结核病[1]。我国是世界上22个结核病高负担国家之一，结核菌感染导致的死亡人数是其他传染病总死亡人数的2倍以上，在活动性结核病患者中，菌阴肺结核患者约占40%～60%[2]。由于缺乏诊断的“金标准”，菌阴肺结核以及病变隐匿的肺外结核病成为诊断中的难点。临床上用于判断结核分枝杆菌感染的首选方法是结核菌素皮试 （tuberculin skin test，TST），但其特异性不够好。近年来，γ干扰素释放试验（interferon gamma release assay，IGRA）作为诊断结核分枝杆菌感染的新方法成为研究的热点。但因试验成本高，目前IGRA在国内的试验资料较少，对我国人群的判断标准尚无定论。本研究拟采用IGRA中的一种T-SPOT.TB检测技术检测结核病患者，以评价T-SPOT.TB对结核病的辅助诊断意义。

Table 1 Comparison of general information between three groups of patients表1 3组研究对象一般情况比较

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2011年1月—7月在我科住院的结核病患者54例，包括肺结核组36例（12例痰涂片阳性），肺外结核组18例（痰涂片均为阴性）。肺外结核组包括结核性脑膜炎4例，结核性腹膜炎2例，结核性胸膜炎11例，肾结核1例，均不合并肺结核。另选取健康对照组31例，无陈旧结核病病灶。以上所有研究对象均无HIV感染、妊娠、使用免疫抑制剂及严重肝肾功能衰竭史，见表1。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT.TB法检测体外干扰素（IFN）-γ 采集受检者外周静脉血5 mL，2 h内常规分离外周血单个核细胞（PBMC）。在活化后预包被好抗IFN-γ抗体的平板中，每孔加入100 μL。阴性对照孔中不加入任何刺激物。阳性对照孔加入5 μL植物血凝素（PHA），终浓度为5 mg/L。实验孔分别加入结核特异抗原A—早期分泌靶向抗原6000蛋白（early secretory antigenic target-6，ESAT-6）和结核特异抗原B—培养滤过蛋白 10（culture filtrate proten-10，CFP-10），终浓度为5 mg/L。然后盖上板盖，放人37℃，5%CO2培养箱中培养16～24 h。第2天洗板，加入检测抗体孵育1 h。洗板后再加入亲和素孵育1 h。最后加入显色剂显色。待显色洗板后晾干，记录ELISPOT斑点形成细胞（spot forming cells,SFCs）计数，抗原A或B任一个＞24 SFCs/1×106即为阳性。

1.2.2 TST 在受试者前臂皮内注射标准纯蛋白衍生物（PPD）0.1 mL （20个国际结素单位/mL），72 h后观察反应结果，记录硬结平均直径。硬结＜5 mm为阴性，硬结≥5 mm为阳性。

1.2.3 相关参考指标测定 采用ELISA法检测结核抗体（TB-AB），魏氏法检测血沉（ESR），酶法连续监测法检测腺苷脱氨酶（ADA）。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件进行分析，计量资料用±s表示，多组比较采用F检验，组间多重比较采用SNK-q检验，计数资料采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组T-SPOT.TB和TST检测结果比较 肺结核组、肺外结核组的T-SPOT.TB阳性率均高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）；肺结核组和肺外结核组的T-SPOT.TB阳性率差异无统计学意义 （P＞0.05）；T-SPOT.TB在结核病中的敏感性是92.6%（50/54）。3组TST阳性率差异无统计学意义（P ＞ 0.05）；TST 在结核病中的敏感性是 55.6%（30/54），见表2。

Table 2 Comparison of results of T-SPOT.TB and TST between three groups of patients表2 3组T-SPOT.TB检测结果与TST皮试结果比较例（%）

2.2 各组相关指标比较 肺结核组、肺外结核组的TB-AB阳性率、ESR、ADA、ESAT-6、CFP-10 水平均高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），肺结核组和肺外结核组的上述指标差异无统计学意义（P＞0.05），见表3。

3 讨论

机体感染结核分枝杆菌后，体内存在特异的效应T淋巴细胞，其在体外再次受到结核菌特异抗原的刺激时，会分泌释放IFN-γ，通过检测IFN-γ的水平或计数分泌IFN-γ的外周血PBMC，可以了解机体在感染结核分枝杆菌后的免疫应答状态，从而发现结核分枝杆菌的潜伏感染，进而辅助诊断结核病。对于结核菌特异性抗原的选定是试验中至关重要的，使用ESAT-6和CFP-10作为抗原，得到了较好的效果，这也使得IGRA得以应用于临床[3]。目前这类试验中，有2种较为成熟的方法，即Quanti FERON-TB GOLD试验（QFT-G）和T-SPOT.TB试验。本研究采用了T-SPOT.TB方法评价IGRA在结核病诊断中的应用价值。

筛选结核菌潜伏感染是IGRA最成熟的应用领域。有试验表明，在99例低危险人群中，只有4%出现了T-SPOT.TB阳性，比TST51%的阳性率低[4]。本研究健康对照组的 TSPOT.TB阳性率为6.5%，优于TST试验，表明T-SPOT.TB的特异性很好。Brodie等[5]对56例结核菌涂片阳性结核密切接触者与40例无接触史者进行病例对照研究，结果显示TSPOT.TB阳性与密切接触具有更好的相关性，T-SPOT.TB更能准确地诊断潜伏性结核感染。

QFT-G试验的敏感性从55%～88%不等，平均75%左右[6]。这个和TST（平均77%）相近。而T-SPOT.TB的敏感性比QFT-G高，因为该试验检测到的IFN-γ就在产生干扰素的单核细胞周围，一旦产生就被结合，而QFT-G试验检测到的是已经弥散在反应体系中的干扰素。有研究表明，224例样本中，T-SPOT.TB的敏感性达96.6%，高于QFT-G的70.1%[1]。Pai等[7]对近3年的13项研究进行Meta分析表明，T-SPOT.TB的综合敏感性为90%。本研究显示，在结核病患者中T-SPOT.TB的敏感性为92.6%。还有试验表明IGRA对于活动性肺内、肺外结核的诊断没有明显差别[8]。本研究中肺结核组和肺外结核组的T-SPOT.TB阳性率无差异，与文献[8]相符。

本研究示肺结核组、肺外结核组TB-AB、ESR、ADA水平均高于健康对照组，故T-SPOT.TB联合TB-AB、ESR、ADA检查等对结核病的诊断意义更大。且基于结核抗原特异性T细胞向病变部位集中的特点，T-SPOT.TB技术的检测物已不仅局限于静脉血，支气管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、脑脊液等也可用于对肺内及肺外结核的诊断[9]。应进一步进行胸腹水的T-SPOT.TB检测研究。

Table 3 Comparison of related index results between three groups of patients表3 3组相关指标结果比较

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