来氟米特联合苯那普利对慢性抗thy1 肾炎大鼠蛋白尿及肾功能的影响

张承英，张建荣，耿燕秋，丁 韬

抗Thy1 肾炎模型是模拟人类肾小球疾病建立的以抗Thy1 抗原单克隆抗体诱导的实验性系膜增殖性肾小球肾炎动物模型。来氟米特是一种新型的免疫抑制药，其活性代谢产物A771726 可选择性地抑制二氢乳清酸脱氢酶(DHOPH)的活性，阻断嘧啶的从头合成，发挥抗增殖作用［1］。来氟米特还可以抑制各种炎性反应刺激诱导的NF－κB 的活化，下调NF－κB 调控基因的表达，发挥抗炎和抑制免疫的作用［2］。本研究拟以血管紧张素转换酶抑制药盐酸苯那普利为对照，观察来氟米特及来氟米特联合苯那普利对慢性实验性系膜增殖性肾炎的疗效。

1 材料与方法

1.1 OX7 抗体的制备与鉴定

1.1.1 OX7 抗体的制备 复苏OX7 杂交瘤细胞，由解放军总医院全军肾脏病研究所提供，用10%的1640 培养液培养生长至细胞密度达到107/ml，pH值7.0 左右，1 ∶2 ～4 传代(传代后细胞密度达到105/ml)，加入10 ml 10%的1640 培养液，培养48 h(细胞上清液变为黄色，细胞密度达到107/ml，pH 7.0)，收集细胞上清，用minipore 离心柱离心(4℃，3000 r/min，30 ～45 min)，浓缩10 ～15 倍，收集浓缩液，用BCA 法测定蛋白浓度，－70 ℃冻存。

1.1.2 OX7 抗体的鉴定 用正常大鼠冷冻切片，采用间接免疫荧光法对OX7 抗体进行鉴定。

1.2 动物模型的制备

1.2.1 实验动物 健康雄性Wistar 大鼠60 只(清洁级)，体重150 ～200 g，由解放军总医院实验动物中心提供并喂养。动物室保持12 h 昼夜循环，室温控制在19 ～29℃，湿度40% ～70%，动物自由摄取水和食物。

1.2.2 动物模型的制备 60 只大鼠适应性饲养1周后进行单侧肾切除。单侧肾切除后将大鼠随机分为5 组:单纯肾切组、模型对照组、来氟米特治疗组、苯那普利治疗组及来氟米特联合苯那普利治疗组(联合治疗组)，每组12 只。除单纯肾切组外，其余各组在单侧肾切除后3 d 尾静脉注射OX7 抗体(100 mg/kg)，1 周后尾静脉连续注射OX7 抗体(每次100 mg/kg，1 次/周，共3 次)，单纯肾切除组在同一时间尾静脉注射PBS，注射抗体后第2 天分组给予来氟米特、苯那普利及来氟米特联合苯那普利治疗，单纯肾切组、模型对照组给予相应量的蒸馏水。

1.3 观察指标 观察各组大鼠的一般情况、体重、尿蛋白、血肌酐。各组大鼠每周称一次体重，按体重调整给药和蒸馏水量。分别于给药前(即0 周)、给药后4 周末、8 周末、12 周末收集、记录24 h 尿量，用考马斯亮蓝法检测尿蛋白浓度，计算24 h 尿蛋白定量。各组大鼠于给药前及处死动物前采血，检测血清肌酐(Scr)水平。

给药4、8 周后分别处死3 只大鼠行肾脏病理检查。10%甲醛固定的肾组织经过常规处理后，石蜡包埋，用2μm 的石蜡切片，进行PAS 染色，由病理医师参照文献［3］方法，在光镜下进行半定量积分。肾小球的硬化程度积分:0 分(正常肾小球);1 分(系膜区扩张或硬化面积＜25%);2 分(硬化面积25% ～＜50%);3 分(硬化面积50% ～＜75%);4分(硬化面积≥75%)。每个标本在400 倍光镜下连续观察50 个不同的肾小球，求平均数作为肾小球硬化指数。小管间质积分:根据病变(肾小管萎缩、管型、间质炎性反应和纤维化)范围，分别给0 ～3分(0 分，无小管间质损害;1 分，轻度＜25%;2 分，中度25% ～＜50%;3 分，重度≥50% )，100 倍光镜下，每个标本观察10 个皮质视野，求平均数作为肾小管间质病变指数。

1.4 统计学处理 用SPSS12.0 统计软件，数据采用±s 表示，不同时间点各组大鼠体重、尿蛋白、血肌酐的比较采用重复测量的方差分析;同一时间点不同组之间的比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差法(LSD)，P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 单纯肾切组大鼠表现机警，反应快，皮毛致密、整齐而有光泽，生长、进食及活动均无明显异常，体重逐渐增加，无死亡。联合治疗组在8周死亡2 只。来氟米特及苯那普利治疗组在10 周分别死亡1 只，其余各组大鼠无死亡。手术时各组大鼠的体重无统计学差异。治疗4、8、12 周时模型对照组及治疗各组大鼠的体重均明显低于单纯肾切组，治疗各组大鼠体重与模型对照组相比，无统计学差异，见表1。

2.2 间接免疫荧光 OX7 抗体在肾小球系膜区呈颗粒样沉积。

2.3 尿蛋白和血肌酐 手术前各组大鼠24 h 尿蛋白量和血肌酐均无统计学差异。单纯肾切组两个指标在整个实验周期内，均无明显变化(P ＞0.05)。模型组及各治疗组两个指标随时间延长而增加(P＜0.05)。治疗4 周时，治疗各组与模型组比较，两个指标均无统计学差异(P ＞0.05)。治疗8 周及12周时，治疗各组与模型组比较，两个指标均显著降低(P ＜0.05)，联合治疗组比单独用药组降低程度更为显著(P ＜0.05，表1)。

表1 不同药物对慢性抗thy1 肾炎大鼠体重、尿蛋白及血肌酐的变化(±s)

表1 不同药物对慢性抗thy1 肾炎大鼠体重、尿蛋白及血肌酐的变化(±s)

注:各组大鼠体重、尿蛋白量及血肌酐水平随时间延长而增加(P ＜0.05);同一时间点，与单纯肾切组比较，①P ＜0.05;与模型组比较，②P ＜0.05;与来氟米特组比较，③P ＜0.05;与苯那普利组比较，④P ＜0.05

项目组别0周4周8周12周n 测量值体重(g)单纯肾切组12 153.20±4.21 12 398.10±12.34 9598.67±34.1测量值n 测量值n 测量值n 26624.56±28.26模型对照组12 151.54±6.35 12 322.35±16.23①9485.68±24.33①6567.21±21.45①来氟米特组12 159.22±8.15 12 289.22±21.25①9453.12±22.14①5528.57±18.22①苯那普利组12 162.11±6.34 12 293.26±15.29①9464.39±18.37①5517.37±15.33①联合治疗组12 154.39±7.66 12 266.87±11.36①7439.45±14.66①4523.39±12.55①24 h 尿单纯肾切组127.73±1.21 129.37±1.74912.36±2.52613.31±2.12蛋白(mg)模型对照组126.52±0.64 1248.29±14.27①988.36±21.37①6154.38±37.22①来氟米特组126.02±1.25 1239.26±11.02①963.12±10.35①②596.67±24.46①②苯那普利组128.33±1.07 1245.23±15.17①951.33±9.56①②③ 577.31±19.58①②③联合治疗组126.38±1.28 1242.11±12.55①734.59±11.27①②③④455.59±21.37①②③④血肌酐单纯肾切组1233.23±5.45 1238.89±6.41940.87±5.21645.34±7.48(μmol/L)模型对照组1236.12±3.46 1255.76±8.17① 987.35±15.43①698.15±17.23①来氟米特组1234.25±5.43 1253.28±9.42① 967.23±13.14①②582.15±21.26①②苯那普利组1237.95±4.34 1250.77±11.16①969.73±9.34①②576.38±17.23①②联合治疗组1235.26±6.12 1251.76±8.53① 752.79±10.61①②③④463.89±12.18①②③④

2.4 肾脏病理 单纯肾切组大鼠肾小球代偿性肥大，毛细血管袢轻度扩张，肾小管及间质无明显改变，排列分布及形态均正常。第4 周，模型组大鼠肾小球系膜细胞轻度增生，系膜基质增多;第8 周，肾小球系膜细胞明显增生，系膜基质增多，毛细血管或扩张或闭塞，肾小球囊壁增厚;第12 周可见部分肾小球节段性或球性硬化，肾小管扩张或萎缩，可见大量蛋白管形，肾间质增宽，可见炎性细胞浸润。各治疗组病变较模型组明显减轻(P ＜0.05，表2)。见图1、2。

表2 不同药物作用下慢性抗thy1 肾炎第12 周大鼠肾脏病理积分(±s)

表2 不同药物作用下慢性抗thy1 肾炎第12 周大鼠肾脏病理积分(±s)

注:与单纯肾切组比较，①P ＜0.05;与模型组比较，②P ＜0.05;与来氟米特组比较，③P ＜0.05;与苯那普利组比较，④P ＜0.05

组别n 肾小球积分肾小管间质积分单纯肾切组60.16 ±0.130.23 ±0.12模型对照组61.69 ±0.27①1.88 ±0.32①来氟米特组51.11 ±0.31①②1.25 ±0.24①②苯那普利组51.07 ±0.19①②1.16 ±0.21①②联合治疗组40.76 ±0.22①②③④ 0.83 ±0.14①②③④

3 讨论

大鼠胸腺细胞膜同肾小球系膜细胞膜上存在共同的表面抗原Thyl，利用抗Thyl 抗体诱导抗原‐抗体反应，形成大分子原位免疫复合物，沉积于肾小球系膜区可引起系膜细胞增殖、系膜基质增多等典型表现，该模型是一种急性、自限性的系膜增生性肾炎模型［4］。采用对单侧肾切除大鼠重复注射抗Thyl抗体的方法，可以诱导不可逆的肾损伤，建立慢性系膜增生性肾炎大鼠模型［5］。OX7 杂交瘤细胞可稳定分泌抗Thyl 抗体，抗Thyl 系膜增生性肾炎大鼠模型是一种经典的系膜增生性肾炎大鼠模型，由于其疾病过程与人类IgA 肾病及其他的系膜增生性肾炎的疾病进程相似，故可以模拟人类的系膜增生性肾炎，用来研究慢性肾脏病的发病机制以及新的治疗策略。

蛋白尿是肾小球损伤的一个标志，也是慢性肾脏疾病进展的一个独立危险因素，降低蛋白尿可以延缓疾病的进展。既往的研究表明血管紧张素转换酶抑制药苯那普利能有效抑制AngⅡ产生，使血压下降同时优先扩张肾血管后括约肌，使出球小动脉阻力降低，肾小球后负荷减轻，从而降低肾小球内压力，降低肾脏高滤过、高灌注性损害，达到保护肾功能的目的。此外血管紧张素转换酶抑制药还可以降低肾小球基底膜的通透性，保护肾小球足细胞，减少肾小球内细胞外基质的蓄积，从而降低蛋白尿，延缓肾衰竭的进展［6，7］。

来氟米特是一种新型的人工合成的异恶唑类药物，由于具有免疫抑制和抗增殖作用，已广泛用于治疗多种自身免疫性疾病和免疫介导性疾病，如类风湿关节炎、狼疮性肾炎及器官移植排异反应。Ogawa 等［8］用来氟米特治疗大鼠抗基底膜肾小球肾炎，结果显示来氟米特能够显著减少尿蛋白、血浆胆固醇及纤维蛋白原，明显改善毛细血管壁IgG 和C3 的沉积。何伟春等［9］用来氟米特治疗大鼠阿霉素肾病模型，发现来氟米特可以减少大鼠阿霉素肾病模型尿蛋白的排泄量。

为了观察来氟米特对慢性系膜增生性肾炎大鼠模型的疗效，笔者以苯那普利为对照，对慢性系膜增生性肾炎大鼠模型加用来氟米特治疗，发现与模型对照组相比，来氟米特治疗可以明显降低模型大鼠的蛋白尿及血肌酐水平(P ＜0.05)，其作用与苯那普利对照组相似。而来氟米特联合苯那普利对慢性系膜增生性肾炎大鼠模型的作用，与单独使用来氟米特或苯那普利组相比，其尿蛋白和血肌酐水平以及肾小球及间质小管病理积分更低(P ＜0.05)，提示联合用药比单独用药效果更好。

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