北冬虫夏草、冬虫夏草及食用菌中核苷类功效成分的比较研究

陆巍杰，唐永范，唐 亮，高瑞栋

（1.上海国宝生物工程研究所，上海 201203；2.上海国宝企业发展中心，上海 201203）

我国的地理位置和自然条件优越，蕴藏着丰富的食用菌资源。到目前为止，我国已经发现720多种食用菌，分别归属于144个属，46个科。其中多数属于担子菌亚门，如香菇、草菇、蘑菇、木耳等；少数属于子囊菌亚门，如羊肚菌、马鞍菌、北冬虫夏草、冬虫夏草等。[1,2]

随着人们生活水平提高、保健意识增强，传统中药冬虫夏草由于其功效卓越，作用温和，受到越来越多的关注，对它的研究也成为世界科学家们关注的焦点。

1 冬虫夏草的现状及人工替代途径

1.1 冬虫夏草生存环境的现状

冬虫夏草分布区自然生态条件严酷，其载体高寒草地生态系统极其脆弱。它对全球变化和人类活动的扰动极其敏感。如果对冬虫夏草资源过度采挖。不仅会对冬虫夏草赖以生存的高寒草地生态系统产生严重影响，而且最终导致冬虫夏草因生态环境恶化而其分布区变小，资源逐渐枯竭[3]。

1.2 冬虫夏草的人工替代途径

1.2.1 有性型冬虫夏草人工培养现状

目前，有性型全人工培植冬虫夏草没有解决虫与菌接种和批量、重复长出子座体的难关，离小面积、小批量、多次重复在低海拔人工培育出有性型冬虫夏草的目标都还十分遥远。由于野生冬虫夏草的宿主蝙蝠蛾幼虫对生长环境要求很苛刻，人工模拟的野生环境极难控制，野生冬虫夏草在人工环境下难以工厂化批量生长。[4,5]

1.2.2 无性型冬虫夏草人工培养现状

虫草菌无性型培养技术容易掌握，从自然界采集冬虫夏草分离出来的真菌，绝大部分理化性质和药理功能与冬虫夏草的有性成分相似，全世界不少机构都把自我分离出的真菌确定为冬虫夏草菌的无性阶段，并纷纷建厂生产菌粉和开发应用。[6]目前已从自然界的冬虫夏草体中分离出中华虫草菌无性型若干种，进行深层大规模发酵培养和固体培养菌丝体和分生孢子体作为有性型冬虫夏草的代用品，部分厂家已进入大的产业化生产。

2 北冬虫夏草与冬虫夏草的区别和比较

全世界目前已发现大约350种虫草，它们形态各异，寄主也各不相同。唯有主产于我国的冬虫夏草和北冬虫夏草最具药用和食用价值。

北冬虫夏草与冬虫夏草比较有以下几个特点：①北冬虫夏草为虫草属的模式种，分布广泛，为世界各国学者所认识和接受。②北冬虫夏草已经形成了在人工条件下育成完整子座的成熟工艺。③北冬虫夏草具有高含量的虫草素和虫草多糖，其独特药理作用已日益引起药学界的高度重视。北冬虫夏草中有效成分种类与冬虫夏草相近，前者中有些成分含量甚至远远高于后者。[7]-[13]

3 各种食用菌功效成分含量的测定与比较

食用菌中的功效成分包括多糖类、核苷类、多肽氨基酸类、三萜类和脂肪类等。其中多糖和腺苷类物质是大多数食用菌都具有的重要成分，虫草属的真菌还含有一种独特的核苷类功效成分——虫草素。为了确定具体12种常见食用菌的主要功效成分，将不同来源的12种常见食用菌进行功效成分含量的测定与比较。

3.1 实验原料：

3.2 液质联用法鉴定虫草属真菌核苷类主要功效成分种类

3.2.1 实验仪器

a. API400型质谱仪；b. 安捷伦1100型液相色谱仪；c. 2487UV双波长检测器；d. 离心机。

3.2.2 实验条件

色谱条件:色谱柱XB-C18，5μm，4.6*250mm；检 测 波 长258nm；流速1.0 mL/min；进样量20μL；

流动相:含0.5%乙酸的水-甲醇（95/5，V/V）体系。

质谱条件:MS：200～400（aum），cur：12，GS1：30 psi，GS2：30 psi，2s，500V，TEM：300℃，DP：40V，EP：8V，进样量5μL。

3.3 各菌菇中多糖、腺苷和虫草素的含量测定与分析

经比较选取了合适的方法对样品进行多糖、腺苷和虫草素含量的测定。[9]-[13]

3.3.1 多糖含量的测定

按照中华人民共和国农业行业标准NY/T 1676-2008，对样品中的总多糖进行测定。

表3-1 实验用食用菌菇产地来源

名 称 产 地福建古田 福建宁德 黑龙江长白山 西藏 青海 上海姬松茸 野生 人工平 菇 野生 人工鸡腿菇 野生 人工牛肝菌 野生 人工灰树花 野生 人工香 菇 野生 人工 野生猴头菇 野生 人工 野生小青蘑 野生小黄蘑 野生白 蘑 野生花脸蘑 野生金针菇人工冬虫夏草 野生 野生北冬虫夏草 野生国宝北冬虫夏草人工

3.3.2 腺苷含量的测定

按照高效液相色谱法（药典2000版 附录VI D）[14]

色谱条件：色谱柱XB-C18，5μm，4.6*250mm； 检 测 波 长260nm；流速1.0mL/min；进样量20μL；

流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.5):甲醇(17:3，V/V)体系。

腺苷平均加样回收率为100.23%，RSD=1.35%。

3.3.3 虫草素的测定方法

依照高效液相色谱法（药典2000版 附录VI D）[14]

色谱条件：色谱柱XB-C18，5μm，4.6*250mm； 检 测 波 长258nm；流速1.0mL/min；进样量20μL；

流动相：含0.5%乙酸的水-甲醇（95/5，V/V）体系。

虫草素平均加样回收率为99.72%，RSD=1.43%。

3.4 结果分析及讨论

3.4.1 组分定性、MS验证西藏野生虫草和国宝北冬虫夏草

经LC-MS组分定性、质谱图比对，在268.0和251.9都出现了质谱峰，说明国宝北冬虫夏草中的两个主要功效成分与野生冬虫夏草中的特有活性成分虫草素和腺苷的核质比一致。经过与文献中野生冬虫夏草的质谱峰对比一致，表明国宝北冬虫夏草中也含有冬虫夏草中的特有活性成分虫草素和腺苷。[8]

3.4.2 各菌菇中多糖、腺苷和虫草素的含量测定结果与分析

由表3-2可以看出：①腺苷普遍存在于常见食用菌中，并且根据食用菌种类的不同腺苷含量各有高低。②本实验收集了我国南方、北方、野生、人工培育的各种食用菌分部位进行腺苷含量测定，发现大多数伞菌的食用菌其菌伞部位的腺苷含量高于菌柄部位的腺苷含量，一般菌伞腺苷含量为菌柄腺苷含量的1-4倍。③虫草属真菌的分部位含量测定比较则是按草和虫两个部位来划分的，其中野生冬虫夏草中的腺苷主要存在于草的部分，虫的部分腺苷含量较低，前者约为后者的3-4倍。国宝北冬虫夏草子实体中的腺苷为0.070%，与西藏虫草（草部位）的0.069%和青海虫草（草部位）的0.071%相近。

表3-2 各种食用菌菇有效成分含量测定

另外，表3-2结果表明：虫草素作为虫草属真菌的特有功效成分，仅存在于冬虫夏草和北冬虫夏草这两个虫草属中，在其他食用菌中均未检出。野生冬虫夏草的虫草素含量较低，约为0.10%左右，但从实验结果可以看到草部位比虫部位的虫草素含量高。野生北冬虫夏草中的虫草素含量是冬虫夏草的10倍左右，而国宝北冬虫夏草子实体中的虫草素含量为1.92%，是野生北冬虫夏草的15倍，超过冬虫夏草150倍。

各地各属种食用菌中的多糖含量都比较高，基本都在10%以上，有的食用菌，如小青蘑、鸡腿蘑甚至超过20%接近30%。通过对伞菌（担子菌亚门）的菌伞和菌柄多糖含量测定比较发现，大多数菌柄中的多糖含量近似等于或略高于菌伞中的多糖含量，前者约为后者的1-1.5倍。而对虫草属的真菌进行检测后发现，野生北冬虫夏草、国宝北冬虫夏草的多糖含量与野生冬虫夏草多糖含量相当，都在10%-13%之间。

4 讨论

由于野生冬虫夏草对生长环境要求苛刻，并且用人工替代培育野生冬虫夏草效果不佳，通过对野生冬虫夏草和北冬虫夏草的LC-MS组分定性、质谱图比对，证实国宝北冬虫夏草中的两个主要功效成分与野生冬虫夏草中的特有活性成分虫草素和腺苷的核质比一致。通过对各菌菇中多糖、腺苷和虫草素的含量测定，表明，腺苷普遍存在于常见食用菌中，许多真菌和植物都含有活性多糖，虫草酸又称为D-甘露醇，仅是普通生化物质。只有虫草素，作为虫草属真菌的特有功效成分，仅存在于冬虫夏草和北冬虫夏草中，是其它食用真菌所不含有的。虫草素作为一种重要的生物活性物质，一直缺乏有利开发。究其原因，一方面是由于生产者对虫草素这一重要活性成分重视程度不够，另一方面也是因为目前尚无相关国家标准指导冬虫夏草及北冬虫夏草中虫草素的含量。国宝北冬虫夏草与野生冬虫夏草中的真菌多糖含量相当，腺苷含量国宝北冬虫夏草高于野生虫草，特有功效成分虫草素含量国宝北冬虫夏草远远高于野生虫草，而且国宝北冬虫夏草培育周期短，人工培育技术成熟，可以大规模生产，是实现野生冬虫夏草工厂化培育的最佳替代品。

研究表明，虫草素具有抗肿瘤、抗白血病、免疫调节、抗纤维化、抗疲劳等多种功效。[15]-[18]以前由于原料稀少、价格昂贵（近期，Sigma虫草素标价为70000元/克），对虫草素的研究还不够深入、系统。现在以虫草素为主要质量指标进行的北冬虫夏草工厂化大规模生产为虫草素的提取提供了充足的原料，如果能够以成熟的工艺、低成本、大批量提取制备虫草素，将虫草素研发成为新一代药物的前景广阔。

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