粒细胞集落刺激因子对小鼠内毒素性急性肝损伤的保护作用

葛成龙 徐 娜 方婷婷 田德英

（华中科技大学同济医学院附属同济医院感染科，武汉 430030）

我国重型肝炎发病率高，抢救治疗难度大，预后极差。肠源性内毒素血症参与重型肝炎各种并发症的发生和发展，严重影响其预后。预防和控制内毒素血症的发生是成功治疗重型肝炎的关键。近年来研究发现，粒细胞集落刺激因子 （granulocyte col－onystimulating factor，G－CSF）除了促进中性粒细胞系造血细胞的增殖、分化和活化外，还具有免疫调节的作用［1］。这种免疫调节作用可能对各种原因所致的肝损伤具有保护作用［2］。为了寻求重型肝炎新的治疗措施，本研究旨在观察G－CSF对小鼠内毒素血症急性肝损伤的作用，并探讨其可能机制。

材料和方法

1.材料

1.1 主要试剂与药品

重组人粒细胞集落刺激因子（recombinant human granulocyte colonystimulating factor ，rhGCSF）（商品名：吉赛欣），华北制药金坦生物技术股份有限公司生产；内毒素（lipopolysaccharide，LPS）（E.coli 055 ：B5），美国sigma公司产品；小鼠TNF－a ELISA 试剂盒、IL－10ELISA 试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 动物

昆明（KM）小鼠，SPF级，均为雄性，18－22g，购自湖北省实验动物研究中心，动物许可证号：SCXK（鄂）2008－0005。

2.方法

2.1 动物模型制备与分组

KM 小鼠腹腔注射 LPS（E.coli 055 ：B5）10mg/kg（参照文献［3，4］）制备小鼠内毒素性急性肝损伤模型。

实验小鼠随机分为3组，每组12只，即①内毒素肝损伤模型组（模型组）；②rhG－CSF预防组（预防组）；③正常对照组（正常组）。模型组腹腔注射LPS（E.coli 055：B5）10mg/kg，预防组于造模前1小时皮下注射rhG－CSF500ug/kg（预实验选定），正常组腹腔注射等剂量的生理盐水。各组分别在注射LPS后6h、24h两个时间点随机抽取6只小鼠，进行观察检测。另外41只小鼠，模型组21只，预防组20只，模型组腹腔注射LPS 30mg/kg，预防组在腹腔注射LPS30mg/kg前1小时皮下注射rhGCSF500ug/kg，观察两组小鼠的存活率。

2.2 观察指标

2.2.1 小鼠的存活率

观察两组小鼠注射LPS 30mg/kg后72h小鼠的存活率。

2.2.2 血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）的浓度

各组小鼠分别在注射LPS后6h、24h用2%戊巴比妥钠麻醉，下腔静脉采血，室温下静置4－6h后，3000r/min离心10min，吸取上层血清，取100μl血清与生理盐水1∶1稀释，全自动生化仪检测AST、ALT浓度。

2.2.3 肝脏组织的病理变化

肉眼观察肝脏形态、色泽、包膜等；取各肝同一部位，置于4%的多聚甲醛溶液中固定后，石蜡包埋，HE染色，光镜下观察肝组织的病理变化。

2.2.4 血清 TNF－a与IL－10的浓度

按小鼠TNF－a、IL－10ELISA 试剂盒操作说明书进行操作。

3.统计学处理

应用SPSS18.0统计分析软件进行统计学处理，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两组存活率比较采用χ2检验，两样本均数比较采用t检验，P值均为双尾值，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.rhG－CSF对小鼠存活率的影响

预防组和模型组小鼠在注射LPS 30mg/kg后12h开始死亡，72h两组小鼠数量基本趋于稳定，预防组20只小鼠存活16只，存活率80%，模型组21只小鼠存活14只，存活率66.67%，两组相比差异无统计学意义（χ2＝0.928，P＝0.335＞0.05）。如表1所示。

表1 rhG－CSF对小鼠存活率的影响Table1 The effect of rhG－CSF on survival rate of the mice

2.rhG－CSF对小鼠肝功能的影响

预防组与模型组相比，6h和24h时间点ALT、AST均明显降低，两组差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01），如图1所示。

图1 rhG－CSF对小鼠肝功能的影响Fig 1 The effect of rhG－CSF on liver function of mice

图3 rhG－CSF对小鼠血清 TNF－a、IL－10的影响Fig 3 The effect of rhG－CSF on the level of serum TNF－a and IL10of mice

3.rhG－CSF对小鼠肝脏病理组织的影响

3.1 肉眼观察

正常组小鼠肝脏形态正常，色泽红润，包膜光滑，质地柔软。模型组小鼠给予LPS后6h肝脏组织轻微肿胀，24h肝脏组织明显肿胀，其中大部分小鼠肝脏表面可见点状及片状出血点。与模型组6h及24h时间点相比，预防组小鼠肝脏充血水肿程度较轻，点状出血点较少，无片状出血点。

3.2 光镜观察

正常组小鼠6h及24h时间点肝细胞形态结构正常，肝索排列整齐，未见炎性细胞浸润。模型组两个时间点均可见肝细胞轻微肿胀、有散在炎性细胞浸润，部分肝细胞出现核固缩，部分区域可见点状及片状坏死。预防组仅见到少量炎性细胞浸润，无点状及片状坏死。如图2所示。

4.rhG－CSF对小鼠血清 TNF－a、IL－10的影响

正常小鼠血清 TNF－a、IL－10表达量极低，造模后这两种细胞因子水平明显升高，而予以rhG－CSF预处理后，抑炎因子IL－10在6h点明显高于模型组（P＜0.05），24h点与模型组相比无明显差异（P＞0.05）。预防组下调血清促炎因子TNF－a的效应与模型组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。如图3所示。

图2 rhG－CSF对小鼠肝脏病理组织的影响（HE×400）Fig 2 The effect of rhG－CSF on liver histopathology of mice（HE×400）

讨 论

重型肝炎是由于各种原因如肝炎病毒、酒精、药物等引起的严重肝脏损害，导致其合成、解毒、排泄和生物转化等功能发生严重障碍或失代偿，从而出现以凝血机制障碍、黄疸、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组症候群。在我国，引起重型肝炎的主要病因是肝炎病毒（主要是HBV），其次是药物及肝毒性物质（如酒精、化学制剂等）［5］。尽管重型肝炎的发病机制尚未完全明确，目前一般认为其发病主要与肠道菌群移位、机体受到内毒素二次打击密切相关。内毒素可以作用于肝脏枯否细胞释放各种细胞因子如促炎因子 TNF－a、INF－γ和抑炎因子IL－10、IL－6，改变促炎因子和抑炎因子的平衡，这种平衡的改变在重型肝炎的发病过程中发挥着重要作用［1］。

G－CSF是一种造血源性细胞生长因子，主要用于各种原因所致的粒细胞减少症，同时它还能诱导骨髓干细胞增殖，并动员入血，使自体骨髓移植成为可能。因rhG－CSF与鼠源性G－CSF有相似蛋白质系列和生物学效应，而被广泛应用于动物实验。近年来有研究表明，rhG－CSF能改善动物各种肝毒性化学物质导致的肝脏损伤，促进肝细胞再生，提高动物的存活率［2，6，7］。然而，也有少部分研究表明rhGCSF不但不能改善动物肝损伤的血清学指标、组织损伤及存活率，甚至抑制肝细胞再生［8，9］。

rhG－CSF保护小鼠急性肝损伤的机制目前尚不明确，大部分研究认为G－CSF主要通过刺激骨髓造血干细胞定植于损伤肝组织，与受损肝细胞微环境相互作用从而增加内源性肝细胞修复进程［2，6，10］。也有学者认为，rhG－CSF保护化学性肝损伤小鼠的作用可能是激发了某种内源性修复机制［7］，通过抑制细胞凋亡而发挥保护作用。Shaklee等［1］研究认为G－CSF能减少LPS诱导的促炎性因子TNF－a和INF－γ的释放，增加抑炎因子IL－6和IL－10的产生，从而导致机体抑炎和促炎平衡发生改变，发挥免疫调节作用。

本研究通过给内毒素性急性肝损伤小鼠预防性皮下注射rhG－CSF，观察造模后6h和24h两个时间点结果，均表明rhG－CSF对内毒素性急性肝损伤小鼠具有保护作用，能明显减低小鼠肝组织病理损伤，降低血清ALT、AST含量，减少肝脏炎症反应，但rhG－CSF并不能提高内毒素性急性肝损伤小鼠的存活率。另外，本研究也初步探讨了预防组与模型组小鼠血清TNF－a和IL－10的含量变化，发现rhG－CSF保护小鼠内毒素性急性肝损伤机制之一可能是增加抑炎性因子IL－10的水平，但其具体机制尚需进一步研究证实。

［1］Shaklee CL，Guo J，Faggioni R，et al.Pretreatment with granulocyte－colony stimulating factor decreases lipopolysaccharide－induced interferon－gamma production in mice in association with the production of interleukin－18.Cytokine，2004，25（3）：119－126

［2］Zhang L，Kang W，Lei Y，et al.Granulocyte colonystimulating factor treatment ameliorates liver injury and improves survival in rats with D－galactosamine－induced acute liver failure.Toxicol Lett，2011，204（1）：92－99

［3］Zhen YH，Fang R，Ding C，et al.Efficacy of specific IgY for treatment of lipopolysaccharide－induced endotoxemia using a mouse model.J Appl Microbiol，2011，111（6）：1524－1532

［4］王琳琳，周娅，梁锦屏等.槐定碱预防小鼠内毒素性肝损伤的作用及对肝脏CD14、TLR4表达的影响.宁夏医科大学学报，2009，31（6）：709－712，722，封3

［5］中华医学会感染病学分会肝衰竭与人工肝学组，中华医学会肝病学分会重型肝病与人工肝学组.肝衰竭诊疗指南.中华肝脏病杂志，2006，14（9）：643－646

［6］Li N，Zhang L，Li H，et al.Administration of granulocyte colony－stimulating factor ameliorates radiation－induced hepatic fibrosis in mice.Transplant Proc，2010，42（9）：3833－3839

［7］Yannaki E，Athanasiou E，Xagorari A，et al.G－CSF－primed hematopoietic stem cells or G－CSF per se accelerate recovery and improve survival after liver injury，predominantly by promoting endogenous repair programs.Exp Hematol，2005，33（1）：108－119

［8］Caraceni P，Giannone F，Catani L，et al.Effects of granulocyte colony stimulating－factor in a rat model of acute liver injury.Dig Liver Dis，2007，39（10）：943－951

［9］Ogiso T，Nagaki M，Takai S，et al.Granulocyte colony－stimulating factor impairs liver regeneration in mice through the up－regulation of interleukin－1beta.J Hepatol，2007，47（6）：816－825

［10］Piscaglia AC，Shupe TD，Oh SH，et al.Granulocytecolony stimulating factor promotes liver repair and induces oval cell migration and proliferation in rats.Gastroenterology，2007，133（2）：619－631