小型四倍体西瓜低稔性胚胎发育研究

詹园凤，郑锋，党选民

（中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南儋州，571737）

人工诱导的多倍体作物具有一定优势，如品质更优、抗性增强等，但也伴随着稔性降低等诸多问题[1，2]。对小型西瓜四倍体育种研究发现，同源四倍体西瓜与二倍体相比，稔性明显下降，有的四倍体西瓜甚至没有正常发育的种子，严重影响四倍体西瓜的育种效率。而有关四倍体西瓜稔性低的原因，在细胞遗传学、生理学等方面进行了部分研究[3～6]。本研究旨在对二倍体与同源四倍体西瓜受精前后生殖特性进行比较研究，探讨四倍体西瓜低稔性的原因，为提高四倍体西瓜结籽率提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料为中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所选育的二倍体高代自交系049（2X）和用Oryazalin诱变的四倍体049（4X）。

1.2 试验方法

①田间试验与样品采集 试验于2010年5月开始在中国热带农业科学院冬季瓜菜研究中心试验基地大棚内进行。催芽后播种于营养钵中，待幼苗长至2～3片真叶时移栽，按常规方法管理。开花期，每天下午将雌花和雄花套袋隔离，次日上午自交授粉，授粉后继续套袋隔离，并挂牌标记。授粉后0.5，1，2，3，4，5，7，9，12 h 摘取不同倍性雌蕊各 5枚； 授粉后 8，12，16，20，24，30，36，42，48，72 h 摘取不同倍性子房各 5 枚；授粉后 4，5，6，7，8，9，10，12，14，16 d取不同倍性子房的胚珠各20粒，所取材料均用FAA固定液保存备用。

②花粉管生长观察 采用荧光染色法观察花粉管生长。雌蕊材料从FAA固定液中取出，依次经过 70%（体积分数，下同）酒精（2 次）、50%酒精、30%酒精、蒸馏水浸泡，每次30 min；将材料放入5 mol/L的NaOH溶液中室温下软化10 min；蒸馏水洗3次；用镊子剥取柱头，将柱头放入苯胺蓝溶液中染色10 min以上；将材料置于载玻片上，滴加1滴染色液，盖上盖玻片并轻压，在荧光显微镜下观察并照相。

③胚胎发育观察 采用石蜡切片法观察胚的发育。子房及胚珠采用爱氏苏木精整体染色法制作石蜡切片[7]，切片厚度为 8 μm；Olympus光学显微镜下观察并照相。

2 结果与分析

2.1 不同倍性花粉粒萌发的观察比较

不同倍性花粉粒在雌蕊柱头上的萌发率不同（图1）。授粉0.5 h后，二倍体与四倍体花粉粒均开始萌发，但四倍体花粉萌发数量明显少于二倍体；授粉2 h后，二倍体与四倍体花粉的萌发率均达到最高，二倍体的花粉萌发率为96.3%，而四倍体的花粉萌发率仅为63.7%。荧光染色观察表明，二倍体花粉粒形态整齐一致，在柱头上分散性好，萌发率较高（图3-1）；四倍体花粉粒大小不一，部分花粉粒畸形失去生活力，因而萌发率较低（图3-2）。

2.2 不同倍性花粉管在花柱中的生长

二倍体花粉管生长速度快，花粉管粗细均匀，生长整齐一致 （图3-3）。四倍体花粉管粗细不均匀，在生长过程中发生扭曲、折叠、盘绕、顶端膨大等异常现象（图3-4）。二倍体花粉粒萌发时只产生一根花粉管，但四倍体花粉粒萌发有时会出现一萌发孔双花粉管（图3-5）、二萌发孔双花粉管（图3-6）和三花粉管等多花粉管现象（图3-7）。

观察结果 （图2）表明，二倍体与四倍体花粉管在花柱内每个时间段的生长速度并不一致。从萌发开始花粉管的生长速度不断加快；在授粉后5 h，二倍体与四倍体花粉管的生长速度最快，二倍体速度为1.293 mm/h，四倍体速度为1.088 mm/h，之后花粉管的生长速度又开始下降。大约在授粉后9 h，二倍体花粉管到达花柱的基部（图3-8），开始进入子房；而四倍体花粉管在授粉后12 h才到达花柱基部（图3-9），生长速度相比二倍体明显要慢得多。

2.3 不同倍性西瓜胚胎的发育

西瓜子房内着生多个倒生胚珠，胚珠中心为珠心，内含有胚囊，整个胚囊为珠心细胞所包围（图3-10）。成熟的西瓜胚囊为寥型胚囊，8核、7细胞的结构，包括1个卵细胞、2个助细胞、2个中央细胞核（极核）和3个反足细胞。胚囊完成双受精后，形成合子与初生胚乳核，而初生胚乳核不休眠、分裂形成胚乳游离核，前期胚乳游离核数量很少，游离在胚囊周围（图3-11）。合子经过短暂休眠后开始分裂，形成基细胞和顶细胞的2细胞原胚，顶细胞经多次分裂形成多细胞原胚（图3-12），之后原胚快速发育成球胚（图3-13），而胚乳游离核则在球胚前期开始由珠孔端向合点端靠近，并与游离在胚囊周围的胚乳游离核一起快速形成一管状的胚乳吸器（图3-14），胚乳吸器顶端插入珠心细胞吸收营养物质，到球形胚晚期胚乳吸器开始细胞化。球形胚晚期远离孔端的细胞分裂加快，靠近珠孔端的细胞分裂速度稍慢，胚体发育成上窄下宽的梨形胚（图3-15）；而胚乳游离核则细胞化并包围在梨形胚周围；梨形胚继续分裂，开始形成子叶原基，胚体发育形成心形胚（图3-17），心形胚迅速演化为鱼雷胚（图3-17），之后细胞化的胚乳吸器开始解体，退化成不规则的条状，发育形成子叶胚（图3-18），而胚乳则完全解体被子叶吸收。

图1 不同倍性花粉粒萌发率的比较

图2 不同倍性花粉管生长的比较

二倍体西瓜授粉约16 h后开始受精，经过2～4 h完成双受精过程。授粉后48 h合子开始细胞分裂形成多细胞原胚；至第3天，原胚发育形成小球胚，随后小球胚发育成大球胚；至第5天，形成梨形胚；至第6天，胚体发育形成心形胚；至第7天，心形胚迅速演化为鱼雷胚。至第9天，鱼雷胚发育形成子叶胚，最后形成成熟的胚。

四倍体与二倍体受精过程、胚胎与胚乳的发育几乎相同，只是受精的时间较晚，胚胎发育时间长些，四倍体西瓜授粉42 h后花粉管进入胚囊，4～6 h完成双受精过程；四倍体原胚期较二倍体时间长，且有部分胚囊败育（图3-19），至第6天才形成小球形胚，第8天形成梨形胚，第9天发育成心形胚，随后快速发育成鱼雷胚，最终形成子叶胚。四倍体胚胎在发育的过程中，因原胚期、球胚期、心形胚期或鱼雷胚期，胚乳细胞过早地解体，而不能够为胚体提供营养，致使胚体退化（图3-19，20），最终败育，形成没有种仁的空种子。

3 结论与讨论

3.1 四倍体花粉粒萌发及花粉管生长与雌蕊的关系

被子植物双受精过程中具有多个识别位点，主要可分为花粉与柱头、花粉管与花柱以及雌雄配子之间3个部位，任何一个部位不能正确识别都有可能产生生殖障碍，导致败育[8]。本试验结果表明，小型四倍体西瓜花粉活力下降，在柱头上的萌发率较低，仅为63.7%；花粉管在柱头内生长缓慢，且花粉管发生扭曲、折叠、盘绕、顶端膨大、出现多花粉管等异常现象，可见花粉在柱头上的萌发以及花粉管的伸长等都受到了不同程度的抑制，导致进入胚囊的花粉管数量减少，双受精成功率较低，这可能是造成四倍体低稔性的重要原因。谭素英等[4]在研究多倍体西瓜花粉萌发生长与内源激素的关系时发现，花粉粒萌发率低，花粉管在花柱中生长缓慢，与花粉中玉米素核苷（ZR）含量过高、雌蕊的生长素（IAA）和赤霉素（GA3）与脱落酸（ABA）的比值低、及花粉和雌蕊共同作用有关。

图3

3.2 四倍体西瓜胚胎败育与胚乳的关系

西瓜胚的发育属于紫菀型，胚乳的发育属于核型。西瓜胚囊在双受精后，胚乳先于合子发育，为幼胚的发育提供营养物质，而胚乳的败育会导致胚的败育。薛志强等[6]对少籽西瓜材料内源激素含量变化与胚胎败育关系研究结果表明，内源激素的相对亏损可能对胚败育起了重要作用，少籽西瓜在球形胚时期，IAA、GA3和异戊烯腺苷（iPAs）的相对亏损达30%～70%，而ABA则相对富足，内源激素动态变化及它们之间的比例平衡与西瓜胚胎败育有着密切联系。谭素英等[3，4]、谢兴刚[5]的研究结果表明，四倍体西瓜在胚发育过程中，因胚乳游离核异常解体或胚乳细胞过早的解体，导致在原胚、球形胚、心形胚或鱼雷胚阶段退化败育，最后只有少数的胚与胚乳发育正常形成有活力的成熟种子。这与本研究结果相似，但本研究的小型西瓜胚胎发育的时间较早，发育速度快，这可能是由于本试验小型西瓜为早熟品种，加上海南的夏季高温影响果实内源激素及养分的积累而导致果实生育期缩短，相关影响机制还有待进一步研究。

[1]张蜀宁，万双粉，张伟，等.同源四倍体青花菜花粉母细胞的减数分裂[J].园艺学报，2007，34（2）：387-390.

[2]中国农业科学院郑州果树研究所.中国西瓜甜瓜[M].北京：中国农业出版社，2000：272-276.

[3]谭素英，梁毅.同源四倍体西瓜胚胎发育研究[J].中国西瓜甜瓜，1998（1）：2-5.

[4]谭素英，梁毅.同源四倍体西瓜自交花粉萌发生长内源激素的关系[J].华北农学报，2000，15（4）：73-78.

[5]谢兴刚.不同倍性西瓜胚胎发育及西瓜组培玻璃苗细胞学研究[D].太原：山西大学，2008.

[6]薛志强，徐道娜，张勇，等.少籽西瓜内源激素含量变化与胚胎败育的关系[J].西北农业学报，2007，16（3）：184-187.

[7]李和平.植物显微技术.2版[M].北京：科学出版社，2009.

[8]徐恒平，曾宗巽.被子植物雌雄配子及其表膜特异蛋白研究进展[J].大自然探索，1995，14（3）：50-55.