整合素干扰载体的构建及细胞转染试验

李维维，张彦明，王 刚，程 敏，陈 婷

（西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100）

整合素（integrin）是一种由α、β两个亚单位组成的异源双聚体跨膜蛋白，能传递跨膜信息、调节细胞功能，在细胞黏附和增殖中起重要作用。整合素αvβ3是一类表达于细胞表面的跨膜糖蛋白黏附分子，由α和β两种Ⅰ型膜蛋白亚单位以非共价键形式连接形成异源二聚体分子。整合素αvβ3在血管生成、胚胎发育、肿瘤转移、免疫应答等多种生理和病理过程中发挥着重要的作用[1－3]。αvβ3特异性识别配体的精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸（RGD）三肽序列，介导细胞与细胞、细胞与细胞质基质（ECM）之间的相互作用，发挥其黏附和信号转导两大基本功能。

试验证明，整合素αvβ3是多种病毒的细胞表面结合位点。例如，Gavrilovskaya IN等研究表明整合素β3可促进汉坦病毒致病毒株感染宿主细胞，并且与汉坦病毒所致疾病的血管通透性改变及血小板功能异常等致病机制有关[4－5]。Berinstein A等发现整合素是口蹄疫病毒的受体[6－8]。人双埃可病毒、轮状病毒、人免疫缺陷病毒等均可通过αvβ3介导进入细胞。但是整合素β3在猪瘟病毒感染中的作用一直鲜有研究，本研究通过RNA干扰的方法建立整合素β3的干扰载体并转染猪血管内皮细胞，为进一步研究猪整合素β3在猪瘟病毒致病机理方面奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和细胞 E.coli DH5α菌株、猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC），由西北农林科技大学动物医学院畜禽疫病防治与畜产品安全实验室保存。

1.1.2 主要试剂 MEM 培养基，GIBCOTM，Invitrogen公司产品；胎牛血清（FBS），Hyclone公司产品；胰蛋白酶，上海生工生物工程技术服务有限公司产品；TrizolⓇReagent，RT－PCR 试剂盒，Invitrogen公司产品；质粒提取试剂盒，威格拉斯公司产品；限制性内切酶EcoRⅠ、BbsⅠ、T 4DNA连接酶及PCR反应试剂、胶回收试剂盒反转录试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.3 主要仪器设备 10μL～1000μL微量加样器，Eppendorf公司产品；PCR仪，美国Bio－Rad公司产品；凝胶成像系统，Syngene公司产品；纯水仪，Millopore公司产品；细胞培养箱，日本三洋公司产品；微波炉，海尔公司产品；8453型紫外分光光度计，Agilent公司产品；滤器、0.22μm混合纤维脂微孔滤膜，上海兴亚净化材料厂产品。

1.2 方法

1.2.1 干扰序列的设计及合成 从GenBank中查找猪整合素β3mRNA 基因（NM－214002.1），参考Gene Pharma Super Silencing shRNA干扰载体设计软件，为保证干扰效果，设计了2个干扰起始的靶位点，分别是编码区第976、1110位核苷酸位点。同时建立干扰载体的阴性对照。质粒载体干扰序列两端包含有BamHⅠ和BbsⅠ两个酶切位点，所有DNA寡核苷酸片段均由上海吉玛生物技术公司合成。

1.2.2 shRNA表达载体的构建 以BamHⅠ和BbsⅠ酶切pGPU6／GFP／Neo质粒载体使其线性化，将合成的寡核苷酸链制备退火双链DNA，连接入经BamHⅠ和BbsⅠ双酶切的pGPU6／GFP／Neo质粒载体。

1.2.3 转化E.coli DH5α感受态细胞及质粒的提取鉴定 在超净工作台中，取出感受态细胞在冰上融化开，加入质粒，轻弹混匀（避免剧烈振荡），置冰上30 min，42℃热激90s（需严格控制时间），立即置冰上2 min，加入800μL无抗生素LB培养基，200r／min振摇30min～60min。划线于含卡那霉素的培养板，然后置37℃培养过夜（不超过16h）。挑取阳性克隆，扩大培养后提取质粒。质粒提取使用威格拉斯公司的质粒小提试剂盒完成，提取的质粒进行凝胶电泳鉴定条带大小。同时进行BamHⅠ单酶切鉴定。

1.2.4 质粒浓度测定及细胞培养 紫外分光光度计在OD260nm和OD280nm测定质粒浓度，为细胞转染提供定量标准。猪脐静脉血管内皮细胞（SUVEC）培养液为含100mL／L胎牛血清MEM培养基，置于37℃、体积分数为5%CO2温箱中培养。转染前1d细胞传代至六孔板，细胞密度以第2天铺满80%为宜。

1.2.5 细胞转染及荧光观察 转染试剂为脂质体2000，按照说明书，六孔板的一孔细胞转染的DNA量为4μg，脂质体2000的使用量为10μL。分别按照上述用量吸取质粒DNA和脂质体至EP管中，并用无血清的MEM培养液分别稀释至250μL。混匀后室温放置5min，然后将两者充分缓慢混合均匀，室温放置30min。单层铺满80%的SUVEC弃掉原来培养液，加入1mL无血清的MEM培养液，再缓慢滴入脂质体与质粒DNA的混合液。轻柔混匀后置37℃、体积分数为5%CO2温箱中孵育4h～6h后吸出混合液，并添加含100mL／L胎牛血清的MEM培养液。转染后24h、48h分别在荧光显微镜下观察细胞转染效率。

1.2.6 RNA提取及反转录 转染后48h的细胞用PBS洗3遍之后，用Trizol裂解细胞，提取细胞总RNA。细胞RNA电泳鉴定完整度之后，利用Takara公司的一步法反转录试剂盒进行细胞中cDNA的合成。反应体系为20μL，加入总RNA 7μL，其他组分按照说明书加样。反应条件37℃，30min；95℃，5s。

1.2.7 猪整合素β3引物设计合成及PCR 从Gen－Bank中查找猪整合素β3mRNA基因（NM－214002.1），利用Primer5软件设计合成β3的引物。引物序列为F：5′－CCATGATCGGAAGGAGTTTGCT－3′；R：5′－AAGGTGGATGTGGCCTCTTTATAC －3′。 引 物 序列由华大基因公司合成。利用Transgen公司的PCR试剂盒的SuperMix进行PCR反应，反应体系为25μL，按照说明书加入PCR反应混合液，并加入1μL的整合素β3的cDNA模板。

PCR退火温度的摸索。设置梯度退火温度，进行PCR反应，退火温度梯度58.6、58、57、55.8、54.9、54.3℃，共6个梯度。摸索出的最优反应条件为：预变性95℃5min；95℃30s，59℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延长10min。12g／L琼脂糖凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 质粒凝胶电泳结果

提取的质粒凝胶电泳后条带在3000bp～5000bp之间，且无非特异性条带出现（图1），证明干扰载体质粒是正确的。

图1 干扰载体质粒凝胶电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of recombinant interference plasmids

2.2 质粒酶切电泳结果

质粒单酶切之后，线性片段DNA凝胶电泳条带为5117bp（图2），证明干扰载体扩大培养后提取的质粒正确无误。

2.3 细胞转染效果

荧光显微镜照片（图3）显示，细胞瞬时转染效果较理想，可达到50%左右。转染后48h的细胞荧光细胞量虽然比24h时稍多，但是细胞死亡较多，荧光强度没有24h时明显。

图2 重组质粒BamHI酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid digested by BamHⅠ

2.4 细胞RNA电泳结果

如图4所示，提取的细胞RNA电泳显示亚基条带明显，证明提取的RNA较完整。

2.5 整合素β3引物退火温度摸索结果

如图5所示，退火温度为58.6℃的PCR产物条带最亮，且非特异性扩增较少。考虑到退火温度与PCR产物之间的关系，取58.6℃的整数，选择59℃为最终的PCR退火温度。

2.6 整合素β3的干扰效果

如图6所示，在相同模板量，且PCR体系相同条件下，在1110干扰位点的干扰片段干扰效果最好，而在976位点的干扰位点相比较对照组，干扰效果不明显。

图3 荧光显微镜下的细胞转染照片Fig.3 The transfected cells under the fluorescence microscope

图4 猪脐静脉血管内皮细胞转染后提取的RNA电泳结果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of RNA extracted from transient transfected SUVEC

图5 不同退火温度下整合素β3的PCR产物电泳结果Fig.5 Agarose gel electrophoresis of integrinβ3PCR products using different annealing temperatures

图6 整合素β3干扰效果凝胶电泳图Fig.6 Agarose gel electrophoresis for integrinβ3PCR products using the template from the transfected cells

3 讨论

整合素β3亚基由2289个核苷酸组成（不包括信号肽），编码762个氨基酸，包含692个胞外结构域，29个跨膜结构域和41个胞内区，该蛋白富含半胱氨酸，共有56个半胱氨酸[9]。干扰载体是目前生物学领域研究比较常用的技术手段，用于在基因水平上干扰某些基因及位点的功能。shRNA是以PolⅠ或PolⅢ类启动子表达发夹状siRNA，它可以通过载体整合到细胞基因组中，产生较持久的基因沉默效应，但其整合可受载体局部结构、细胞的特异性、细胞状态等多种因素影响，因此有不同干扰效率[10]。用RT－PCR的方法检测转染了干扰载体的细胞中整合素的干扰效果，结果表明，干扰载体在1110核苷酸片段处干扰效果最好，为进一步研究猪瘟病毒在整合素β3表达量下调的细胞中的增殖奠定了基础。本试验为去除载体本身对细胞的干扰作用，设定了空白载体对照组，即不能表达干扰片段的空载体，将其同步转化E.coli DH5α菌株，并转染细胞。为确定转染的质粒确实是我们设计好的含有干扰载体的质粒，我们将提取的质粒用凝胶电泳的方法检测完整质粒的条带大小，结果显示各个质粒条带清晰均一，且无杂带出现，初步表明质粒的纯度和均一性很好。另外，利用载体中的BamHⅠ酶切位点进行单酶切，判断质粒条带大小，凝胶电泳显示各条带均在5117bp左右，与载体序列（5117bp）大小一致。为了最大程度的避免转染效率的不同，我们在质粒提取之后用紫外分光光度法测定质粒浓度，定量后以统一的质粒量转染细胞。在24h及48h分别收取细胞，提取RNA。RTPCR后检测干扰效果。

整合素在病毒上的作用的研究由来已久。1995年，Berinstein A 等[6]研究证明，口蹄疫病毒（FMDV）对培养细胞的感染可被αvβ3的抗血清和αvβ3的单克隆抗体阻断，怀疑αvβ3是FMDV侵染细胞的受体之一。Neff S等[11]发现病毒与整合素αvβ3的结合依赖于FMDV中的RGD序列结构，同时认为整合素αvβ3可能是FMDV的受体。Guerrero C A 等[12]将vitronectin（透明连接蛋白，αvβ3的配体）和β3的单克隆抗体分别与MAl04细胞悬液孵育，再用RRV、nar3或 Wa 3种轮状病毒分别感染细胞，发现不管是vitronectin还是β3的单克隆抗体，都可降低病毒感染率，但对病毒的吸附没有影响。在体外，整合素αvβ3是汉坦病毒（Hantaan virus，HTNV）在内皮细胞上的受体；在体内，整合素αvβ3对HTNV的感染也很重要，但同时HTNV可能也需要β3以外的受体介导作用[3]。Raymond T等[13]发现整合素αvβ3在非激活状态下，汉坦病毒可与它的一个特定结构域结合，而病毒与这一结构域的相互作用使得整合素αvβ3调整血管通透性的功能受到抑制。现有的研究认为整合素αvβ3可以是汉坦病毒属病毒的感染受体，但除此以外是否还有其他分子的参与，仍有待进一步深入研究。

唐青海等[14]研究发现，感染猪瘟病毒的猪脐静脉血管内皮细胞中整合素β3表达量上调，为研究整合素β3与猪瘟病毒的相互作用提供了前期试验基础。本试验成功构建了整合素β3的干扰载体转染细胞后，利用RT－PCR的方法检测细胞中整合素β3的mRNA表达量，发现在1110位点的干扰片段干扰效果较佳。且干扰载体中带有荧光标记和筛选基因，为后续筛选阳性细胞及进行各方面检测奠定了基础。

[1]史 菲，邱 晨，彭文科.靶向小鼠整合素β1的shRNA表达载体构建及鉴定[J].海南医学，2011，22（18）：4－6.

[2]Li D F，Zhang M C，Yang H J，et al.β－integrin mediates WSSV infection[J].Virology，2007，368（1）：122－132.

[3]姜 泓，白雪帆.整合素avβ3与病毒感染[J].病毒学报，2007，23（6）：494－497.

[4]Gavrilovskaya I N，Brown E J，Ginsberg M H，et al.Cellular ent ry of hantaviruses which cause hemorrhagic fever with renal syndrome is mediated by beta3integrins[J].J Virol，1999，73（5）：3951－3959.

[5]Gavrilovskaya I N，Peresleni T，Geimonen E，et al.Pathogenic hantaviruses selectively inhibit beta3integrin directed endothelial cell migration[J].Arch Virol，2002，147（10）：1913－1931.

[6]Berinstein A，Roivainen M，Hovi T，et al.Antibodies to thevitronectin receptor（integrin alpha（v）beta（3）inhibit binding and infection of foot－and－mouth disease virus to cultured cells[J].J Virol，1995，69（4）：2664－2666.

[7]Duque H，Baxt B.Foot－and－mouth disease virus receptors：comparison of bovine alpha（v）integrin utilization by type A and O viruses[J].J Virol，2003，77（4）：2500－2511.

[8]Donnell V O，LaRocco M，Duque H，et al.Analysis of footand－mouth disease virus internalization events in cultured cells[J].J Virol，2005，79（13）：8506－8518.

[9]Du Junzheng，Chang Huiyun，Gao Shandian，et al.Molecular characterization and expression analysis of porcine integrins αVβ3，αVβ6andαVβ8that are potentially involved in FMDV infection[J].Mol Cell Probes，2010，24（5）：256－265.

[10]杜文婷，任思冲，所起凤，等.Sirt1基因shRNA干扰载体构建及其对细胞增殖和凋亡的影响[J].生物医学工程学杂志，2011，28（5）：972－975.

[11]Neff S，Mason P W.High－efficiency utilization of the bovine integrin alpha（v）BeTa（3）as a receptor for foot－and－mouth disease virus is dependent on the bovine beta3subunit[J].Virology，2000，74（16）：7298－7306.

[12]Guerrero C A，Mendez E，Zarate S，et al.Integrin alpha（v）beta（3）mediates rotavirus cell entry[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（26）：14644－14649.

[13]Raymond T，Gorbunova E，Gavrilovskaya I N，et al.Pathogenic hantaviruses bind plexin－semaphorin－integrin domains present at the apex of inactive，bent alpha（v）beta（3）integrin conformers[J].Proc Natl Acad Sci USA，2005，102（4）：1163－1168.

[14]Tang Q H，Zhang Y M，Xu Y Z，et al.Up－regulation of integrinβ3expression in porcine vascular endothelial cells cultured in vitro by classical swine fever virus[J].Vet Immunol Immunopathol，2010（133）：237－242.