玉米苗枯病病原菌的分离及鉴定

何 瑞，王建明

（山西农业大学信息学院，山西太谷 030801）

玉米是我国的重要粮食作物，栽培面积仅次于小麦、水稻，居第3位。玉米产量的高低受多种因素影响，包括杂交种的增产潜力、气候条件、栽培措施、水肥管理、病虫害的发生等。玉米苗枯病是世界上广泛发生、为害严重的玉米病害之一。近几年，由于大量种植感病品种、种子带菌和生长前期不良气候以及粗放的栽培管理等原因，造成该病害呈现出发病范围广、发病面积大、为害程度重的趋势，严重影响着我国玉米的产量，已成为我国玉米生产上亟待解决的问题[1]。其在我国发生时间较短，20世纪90年代初只在部分玉米产区点片发生，但由于种子带菌，玉米苗枯病在我国发生的面积逐年扩大，很快波及到我国主要的玉米产区。玉米苗枯病的发生受多种因素影响，种子带菌是苗枯病发生的前提，土壤通气性差、湿度过大、土壤中钾素的缺乏等有助于苗枯病的发生[2-4]。致病菌有串珠镰刀菌、串珠镰刀菌胶孢变种、禾谷镰刀菌、炭黑蠕孢菌、立枯丝核菌等8种，还有地方报道为串珠镰刀菌（F.moniliforme）与禾谷镰刀菌（F.graminearum）共同侵染，其中，串珠镰刀菌是玉米苗枯病的主要病原菌，该致病菌为弱寄生菌，在土壤中一般可存活2～3 a。

本研究通过对致病菌分离、鉴定并利用PCR技术对其DNA进行扩增和序列分析，进一步确定该地区苗枯病的致病菌种类及其分类地位，且对玉米苗枯病的发病规律及其症状进行了研究，以期为该病的防治和抗病育种工作提供依据[5]。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株 玉米苗枯病病株采自山西省昔阳县。

1.1.2 主要试剂及仪器 试剂包括PSA培养基、大米饭、Bilai，s培养基、DNA抽提液、PCR 扩增药品；仪器包括试管、培养皿、解剖镜、显微镜、离心机、PCR仪等。

1.2 试验方法

1.2.1 玉米苗枯病病原菌的分离、纯化、培养及保存 以常规组织分离法对采集的玉米苗枯病病标样进行病原物分离。叶片组织经消毒后，在病斑区域切取小块，置PSA平板上于25℃下黑暗培养。待菌落形成后，进行镜检，挑取单孢于PSA平板上纯化培养。切取纯化后培养物菌落边缘的菌丝置于PSA斜面培养，待充分生长后，保存于4℃冰箱里。使用时挑取少量的菌种转入PSA平板上，25℃下培养备用。

1.2.2 致病性测定的接种及调查方法 分离物在PSA平板上培养。待菌落长满PSA平板后，用蒸馏水洗下分生孢子，配置成浓度1×106个/mL分生孢子的孢子悬浮液，再加上少许吐温摇匀，接种5个玉米健株。在植株长到6～7叶期进行接种，接种后保湿24 h，湿度大于90%，温度保持在25～30℃之间。10 d后调查玉米植株的发病情况，并从发病的植株上再分离病原[6]。

1.2.3 病原菌的形态学特性测定 挑取少量纯化的菌丝于PSA上培养，观察菌落的形态、颜色等培养特性，挑取分生孢子在显微镜下观察孢子形态。在解剖镜和显微镜下观察病原菌在玉米茎秆上形成的孢子形态，使用DFC320数码摄像头配合Qwin V3软件记录其形态并测量大小。详细忘录PSA平板上的菌落形态、产孢情况[7-8]。

1.2.4 病原菌rDNA-ITS的扩增与序列分析

1.2.4.1 病原菌总DNA的提取 菌丝培养用查氏培养液在振荡培养箱中27℃培养7 d，经过滤收集菌丝，提取方法参照SDS法[8]。

1.2.4.2 rDNA-ITS扩增与序列测定 采用真菌核糖体基因转录间隔区通用引物ITS4（5'-TCCTC CGCTTATTGATATGC-3'），和ITS5（5'-GGAAGTA AAAGTCGTAACAAGG-3'）扩增该病原菌的ITS区，预计扩增片段为600bp。PCR扩增体系（50μL）为：DNA模板 1.0μL，引物 1（10μmol/L）1.0μL，引物 2（10 μmol/L）1.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.0 μL，10×Buffer 5.0 μL，5 U Taq 酶 0.3 μL，用ddH2O使终体积达到50 μL。扩增程序：94℃预变性7 min；94℃变性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，扩增30个循环；最后72℃延伸7 min。反应终止后，取5 μL PCR产物，用1.0%琼脂糖电泳检测扩增结果。委托北京天根生物工程有限公司进行纯化和序列测定。

1.2.4.3 病原菌ITS序列同源性比较 测序后的序列经校正后，在核酸序列数据库GenBank中进行同源序列搜索，比较测试菌株同现有数据库中相应序列的相似程度。在GenBank上选取同属的代表性菌株，并以Gaeum annom yces gram in is

[9]作为序列分析的外群[10]。

2 结果与分析

2.1 玉米苗枯病的危害与症状特点

近几年，制种玉米苗枯病发生严重，并有发展趋势，重病田发病率高达30%以上，甚至有的田块严重缺苗，翻犁改种，已成为影响制种玉米高产、农民增收的重要问题。玉米苗枯病主要发生在5月中下旬（玉米4～7叶期），症状表现为叶片边缘首先出现黄褐色枯死条斑，个别叶片或植株出现萎蔫，3～5 d后叶片变青灰色或黄褐色枯死。发病株根毛初期出现淡黄色至黄褐色侵染点，1～2 d后即变为黄褐色水渍状坏死，严重时皮层腐烂，根毛脱落（图1）。拔起病株，发现在根部发病部位有时出现白色、灰白色或粉红色霉状物，即病原菌分生孢子梗和分生孢子（图2）。

2.2 苗枯病病原菌的形态鉴定

2.2.1 培养性状

从图3可以看出，（1）生长速度：在PSA培养基上25℃，4 d的菌落直径为4.6～4.7 cm。（2）PSA培养基上：气生菌丝棉絮状，白色至淡牵牛紫。基物表面淡紫，基物不变色。（3）米饭上：气生菌丝为白色至粉色。（4）Bilai，s培养基上：气生菌 丝粉状，白色。

2.2.2 形态特征 （1）小型分生孢子（图4）：数量多、椭圆形、瓜子形，串状着生，无隔。量度：（15.4～35.5）μm×（6.2～8.8）μm。（2）大型分生孢子（图5）：PSA培养基上未见。在米饭培养基上，孢子镰刀形，细长，中间较直，两端稍弯曲，向两端变化均匀，顶胞渐尖，基孢足跟不明显，隔膜易消解，2～4分隔，多为3分隔。量度：（44.9～64.6）μm×（7.0～9.0）μm。（3）产孢细胞类型：单瓶梗，产孢梗短。（4）厚垣孢子：无。

对病原菌分生孢子的分隔和量度进行了抽样测量，结果（表1）显示，20个病害标样的10个病原菌株的鉴定均获得基本一致的结果，表明山西省昔阳县玉米苗枯病病菌的组成比较单一，根据病原菌形态特征的描述，初步鉴定该病原菌可能是串珠镰刀菌（F.moniliforme）。

表1 分离菌株分生孢子的分隔和量度

2.3 病原菌致病性测定

将纯化后的菌株重新接种到健康的玉米叶片上，回接7～9 d，接种菌丝块、孢子悬浮液的玉米叶片全部发病，有伤口的叶片发病比无伤口的叶片早1～2 d，症状与田间观察相同，对照不发病；用发病的病斑进行常规分离，再次获得与原来分离菌基本一样的病原菌，根据柯赫氏法则，证明接种菌即为玉米苗枯病的病原菌。

2.4 病原菌的序列分析及同源性

引起玉米苗枯病的病菌主要有串珠镰刀菌和禾谷镰刀菌，为进一步确定山西昔阳县的玉米苗枯病是否为串珠镰刀菌，本研究分析了该菌的ITS区序列。菌株的PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，得到1个600 bp左右的片段（图6），经序列测定，确定该片段长度为592 bp（图7），与预期结果一致。将测得的序列在GenBank中进行同源序列搜索（BLAST搜索），结果表明，所测得的序列与串珠镰刀菌（F.moniliforme）同源性为100%，进一步证明引起山西省昔阳县玉米苗枯病的病原菌为串珠镰刀菌。

图7 串珠镰刀菌（F.moniliforme）ITS区序列片段

3 讨论

本研究将引起山西昔阳县的玉米苗枯病的病原菌鉴定为串珠镰刀菌（F.moniliforme），有的地方报道的苗枯病病原菌为禾谷镰刀菌（F.graminearum），致病菌有串珠镰刀菌、串珠镰刀菌胶孢变种、禾谷镰刀菌、炭黑蠕孢菌、立枯丝核菌及腐霉菌等8种，还有的地方报道为串珠镰刀菌（F.moniliforme）与禾谷镰刀菌（F.graminearum）共同侵染[11]。本研究表明，不同地区引起玉米苗枯病的病原菌的确存在不同，所以，明确各地的病原种类，对进一步研究该病的发生与流行，以及通过品种改良来提高品种抗病性均具有重要意义。本研究结果还表明，山西昔阳县发生的玉米苗枯病的病原菌在传统生物学特性及致病性上无明显差异，病原菌结构比较单一，这对于病害的防治与抗性的选育是十分有利的。

串珠镰刀菌（F.moniliforme）种级鉴定标准是以分生孢子的大孢子和小孢子形态为主、培养特征为辅和寄主范围作参考的综合特征来确定的，但镰刀菌中许多种的分生孢子都较相似，对于非专业分类研究来说，单从分生孢子形态学的特征上较难鉴定苗枯病。此外，一些学者认为，仅根据形态学特征来进行苗枯病的鉴定与分类通常是不适当的。rDNAITS是介于18 SrDNA，5.8 S rDNA和28 S rDNA之间的区域，该区域进化速度较编码区快，可以提供足够多的变异来进行种间和种内的分子系统研究[10]。随着分子生物学技术的发展，rDNA-ITS序列分析已被广泛应用于各种病原真菌的分类和系统发育研究中。

本研究以传统的形态学特征为基础，并对山西昔阳县玉米苗枯病病原菌的rDNA-ITS序列进行分析和比较，从分子生物学水平上进一步鉴定引起山西昔阳县玉米苗枯病的病原菌为串珠镰刀菌，为进行该病害的防治和抗性品种选育研究提供了一定的理论依据。

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