紫外-可见分光光度法测定细毡毛忍冬中总黄酮的含量

郑光雅，马逾英，翟萌，穆向荣，金丽鑫

金银花为常用中药，具有清热解毒、疏散风热等功效，广泛应用已有悠久历史，为治疗各种热病、风病、温病的首选药物。金银花除供药用外，还广泛应用于食品、保健品、护肤品、日用化工等。川产金银花主流品种为细毡毛忍冬Lonicera similes Hemsl，该种资源丰富，使用历史悠久。

细毡毛忍冬的主要成分除有机酸外，还含黄酮类、皂苷类、环烯醚萜及挥发油等。其中黄酮类化合物是一类生物活性很强的化合物，具有抗衰老、增强机体免疫力、抗癌防癌的功效[1]，在医药、食品等领域具有广阔的应用前景。目前对黄酮类化合物含量测定方法的研究甚多，研究表明目前总黄酮含量测定以分光光度法为主，此方法在金银花[2]、枸杞[3]、凤仙花[4]、南红豆杉[5]、甘草[6]、黄芪[7]等众多中药的总黄酮含量测定中得到了广泛应用。

本文以芦丁为对照品，采用紫外-可见分光光度法在波长510 nm处测定细毡毛忍冬中的总黄酮含量，对细毡毛忍冬的化学成分及其含量有一个系统、全面的了解，为深入研究并综合开发川产金银花的主流品种细毡毛忍冬的药用价值和经济价值提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 药材

实验所用细毡毛忍冬药材采购于四川省南江县，经成都中医药大学马逾英教授鉴定，为忍冬科植物细毡毛忍冬Lonicera similis Hemsl。

1.2 试剂

芦丁标准品（由中国药品生物制品检验所提供，批号：100080-200707）；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠均由成都市科龙化工试剂厂提供；蒸馏水（自制）。

1.3 仪器设备

旋转蒸发仪RE-5203（上海亚荣生化仪器厂）；循环水式多用真空泵SHB-Ⅲ（郑州长城科工贸有限公司）；电子天平TD6001（天津天与仪器厂）；紫外-可见分光光度计UV1100（上海天美科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

细毡毛忍冬干燥花蕾4.75 g，采用文献方法[8～9]进行提取，即用90%、80%、70%的乙醇回流提取，物料比为1∶8，过滤，减压回收乙醇，得浸膏0.95 g，（即1 g浸膏相当于5 g生药量）。精密吸取浸膏0.5 g，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加75%乙醇至刻度，摇匀。精密量取1.0 mL，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，摇匀，即得（浓度为0.001g生药 mL-1）。

2.2 对照品溶液的制备

取芦丁对照品约25 mg，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇适量，超声处理使溶解，放冷，加75%乙醇至刻度，摇匀。精密量取20 mL，置50 mL容量瓶中，加75%乙醇至刻度，摇匀，即得（浓度为0.2 mg mL-1）。

2.3 波长的选定

精密吸取芦丁对照品溶液和供试品溶液适量，以亚硝酸钠-硝酸铝显色，空白试剂为对照，于200～800 nm波长范围内扫描。结果表明，对照品溶液在510.5 nm处有最大吸收，供试品溶液在509.3 nm处有最大吸收，如图1所示。

由于供试品中黄酮种类多，造成最大吸收与对照品有微小的差异，考虑到以对照品来计含量，故选择510nm为测定波长。

2.4 线性关系的考察

图1 芦丁对照品溶液和供试品溶液UV-VIS扫描图Fig 1 UV-VIS scans of rutin standard solution and sample solution

精密量取对照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分别置25 mL容量瓶中，加5%亚硝酸钠溶液1.0 mL，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液1.0 mL，摇匀，放置6 min，加10%氢氧化钠溶液1.0 mL，再加水定容至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，照紫外-可见分光光度法（《中国药典》2010年版一部附录VA），于510 nm波长处测定吸光度。以吸光度（A）为纵坐标，浓度C（μg mL-1）为横坐标，绘制标准曲线。

求得回归方程：A=0.0137C+0.0008，r=0.9999，n=6。测定结果见表1、图2。结果表明，芦丁对照品溶液在8.0179～48.1074 μg mL-1浓度范围内，吸光度与浓度呈良好线性关系。

图2 芦丁对照品溶液标准曲线图Fig 2 The standard curve of rutin standard solution

表1 芦丁对照品标准曲线绘制结果Table 1 Results of the standard curve of rutin standard solution

2.5 精密度试验

精密量取对照品溶液0.2 mL，置于10 mL容量瓶中，用75%乙醇定容，于510 nm处测定其吸光度，重复测定5次，计算相对标准偏差值(RSD)。

测得细毡毛忍冬总黄酮含量的RSD值为0.31%，表明仪器的精密度良好。

2.6 稳定性试验

精密称取4.7508 g细毡毛忍冬，按“2.1”方法制成供试液，于510 nm处测其吸光度，每隔30 min测1次，连续测定6次计算RSD值。

测得细毡毛忍冬总黄酮含量RSD值为0.32%，表明试验在3小时内稳定，满足测定要求。

2.7 重复性试验

称取同一批细毡毛忍冬样品5份，按“2.1”方法制成供试液，于510 nm处测定吸光度，计算样品含量及RSD值。

结果表明，5次测得的平均含量为3.38% ，RSD值为0.66% ，说明该方法的重复性良好。

2.8 样品含量测定

表2 样品中总黄酮含量测定结果Table 2 Results of determination of total fl avonoids in samples

精密称取4.7502 g细毡毛忍冬，按“2.1”方法制备样品供试液，以75%乙醇作为空白对照，于510 nm处测定吸光度，代入标准曲线计算样品中总黄酮的含量。

结果见表2，计算得样品中总黄酮含量为3.38%。

3 结论与讨论

芦丁是细毡毛忍冬中的主要黄酮类成分，以芦丁为对照品测定细毡毛忍冬中总黄酮的含量，结果较可靠。

该研究在对细毡毛忍冬中总黄酮含量进行测定时，分别尝试了用浓HC1-Mg粉法和NaNO2-A1(NO3)3-NaOH法进行测定，前者因存在色素类成分的干扰，不能用于细毡毛忍冬总黄酮的含量测定；后者操作简单，准确度高，重现性好，对仪器要求不高，可作为细毡毛忍冬中总黄酮含量的检测方法。除此以外，该研究对显色剂的用量和显色时间进行了考察，结果表明：室温下放置6 min样品液，吸光度基本稳定；加入10%NaOH溶液1 mL显色，吸光度值较为适中。

[1] 张彬,李彩侠,吴亚卿.黄酮类化合物的研究进展[J].食品与药品,2005,2l(5):70.

[2] 宋琳琳,冉军舰.金银花中总黄酮提取条件优化研究[J].安徽农业科学,2008,36(32):14151.

[3] 张颖,张立睦,周红英.不同产地枸杞子中黄酮含量的测定[J].中国中医药科技,2004,11(2):102.

[4] 李晓明,姜华,李军,等.分光光度法测定凤仙花中总黄酮的含量[J].安徽农业科学,2009,37(33):16378.

[5] 孔繁晟,严春艳,贲永光,等.紫外分光光度法测定云南红豆杉枝叶中总黄酮的含量[J].时珍国医国药,2009,20(2):471.

[6] 周斌,常军,刘可越,等.紫外分光光度法测定甘草中总黄酮的含量[J].安徽农业科学,2009,37(31):15246.

[7] 董顺福,韩丽琴,刘建华,等.黄芪等中药总黄酮与金属元素含量测定及聚类分析[J].时珍国医国药,2010,21(3):650.

[8] 许小方,李会军,李萍,等.灰毡毛忍冬花蕾中的化学成分[J].中国天然药物,2006,4(1):45.

[9] 罗咏婧,李会军,李萍等.毛花柱忍冬花蕾化学成分研究[J].林产化学与工业,2010,30(1):73.