美珍颗粒剂对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜保护作用及机制研究*

龙 惠 严 莉 黄国栋 黄媛华 蒋 芳 柯诗文 余淑娇

（1.广东省广州市皮肤病防治所，广东 广州 510095；2.南昌有色冶金设计研究院，江西 南昌330006；3.南昌大学第一附属医院，江西 南昌 330006；4.湖南中医药大学附属衡阳医院，湖南 衡阳 421001）

溃疡性结肠炎（UC）是一种病因及发病机制尚不明确的结肠炎性病变［1-3］。近年来UC常采用激素和柳氮磺胺吡啶（SASP）及中药口服结合灌肠治疗，但副作用大。本研究采用美珍颗粒剂进行抗UC的实验研究，以期获取双歧杆菌等肠道细菌计数等反映抗UC疗效的关键指标，同时检测肠黏膜组织核转录因子κB（NF-κB）及血清白细胞介素（IL）-1β 和 IL-6 的表达，并与SASP对照，旨在进一步探讨美珍颗粒剂在UC发病中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级Wistar大鼠80只，雄性，体质量200 g左右，11～13周龄，由南昌大学医学院动物科学部提供。

1.2 药物与试剂 2，4二硝基氯苯（DNCB）和美珍颗粒剂（由南昌大学第一附属医院中药房提供）；NF-κB及IL-6单克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司），IL-1β试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。超氧化物歧化酶 （SOD），过氧化脂质（LPO）免疫组化检测及其相关试剂由晶美有限公司提供。

1.3 分组与造模 将大鼠随机分为美珍颗粒剂组、SASP组、模型组、正常组，每组均为20只，除正常组外其余3组动物进行造模。大鼠颈背部剃毛后，每日以2%DNCB丙酮液滴背1次，每次5滴，连用7 d致敏。其后每日向大鼠肛内深度6 cm处的结肠肠腔轻缓灌注0.45%DNCB乙醇液1次，每次0.25 mL，连续5 d，得到 UC 大鼠模型［4］。

1.4 给药方法 造模结束后，美珍颗粒剂组按100 mg/kg体质量灌胃美珍颗粒剂，每日1次；SASP组按100 mg/kg体质量灌胃SASP，每日1次。正常组不作任何处理，正常喂养。模型组灌胃0.9%氯化钠注射液100 mg/kg，每日1次。所有动物均治疗4周。

1.5 标本采集与检测 第5周腹主动脉无菌取血4 mL左右，采用双抗体夹心ABC-ELISA法检测血清IL-1β和IL-6的表达，随后断头处死，剪取病变最明显处结肠组织，冰冻保存常规病理切片并摄像，计算结肠损伤分数，免疫组化检测肠黏膜NF-κB的表达。结肠损伤分数，以结肠黏膜损伤点的长度计算，即≤0.5 mm为1分，≤1 mm为2分，≤2 mm为3分，以次类推，损伤点宽度≥2 mm时，分数加倍。SOD：按文献［5］的肾上腺素法略加改进进行测定。结肠黏膜LPO［6］测定，在刮取胃黏膜中按1∶10加入1 mL 4℃的0.3 mol/L蔗糖液，匀浆，以4000 r/min离心10 min，取上清液测酶活性，其中取一部分结肠黏膜迅速浸入4%多聚甲醛0.1 M/PBS（含 1/1000 DEPC）中固定，制备4 μm厚石蜡连续切片，免疫组化检测肠黏膜NF-κB的表达。免疫组化按即用型一步快速免疫组化Max Vision TM试剂盒说明书操作。

1.6 统计学处理 应用SPSS10.0统计软件。计量资料以（±s）表示，治疗前后比较采用配对t检验，组间比较经方差齐性分析后采用成组设计的t检验。相关分析采用Bivariate Two-tailed检验，求Pearson系数。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病理切片 HE染色后镜下观察各组大鼠的组织学损伤情况：正常组大鼠的结肠黏膜结构完整，腺体排列整齐，未见明显炎性细胞浸润。模型组大鼠结肠黏膜结构遭严重破坏，部分区域黏膜坏死、脱落，有些病变深达黏膜下层、肌层或浆膜层；黏膜内腺体排列紊乱或缺如，细胞高度水肿，充血明显，并呈局灶性出血，细胞间质可见大量炎性细胞浸润。SASP组、美珍颗粒剂组大鼠结肠黏膜均见愈合，但美珍颗粒剂组愈合最好。

2.2 结肠损伤分数和大便乳酸含量比较 见表1。从溃疡的发病程度上来看，模型组、美珍颗粒剂组及SASP组均可见溃疡形成，以模型组的损伤分数和大便乳酸含量最高，而美珍颗粒剂组及SASP组的损伤分数和大便乳酸含量均较模型组明显降低（P＜0.05），而美珍颗粒剂组尤为显著（P＜0.01）。

表1 各组结肠损伤分数和大便乳酸含量比较（±s）

表1 各组结肠损伤分数和大便乳酸含量比较（±s）

与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与 SASP 组比较，△P＜0.01。 下同。

组 别 n 结肠损伤分数 大便乳酸含量（mg/10 g）正常组 20 0 6.25±0.21模型组 20 18.12±1.01 6.14±0.21 SASP 组 20 11.41±1.01* 3.62±0.21*美珍颗粒剂组 20 4.71±1.01*△ 1.71±0.21*△

2.3 各组红细胞SOD及结肠黏膜LPO含量比较 见表2。与正常组SOD含量相比，模型组、美珍颗粒剂组及SASP组SOD含量均下降，组间比较有显著差异（P＜0.05），而美珍颗粒剂组及SASP组的SOD含量均较模型组明显升高，而美珍颗粒剂组尤为显著（P＜0.01），而与正常组的LPO含量相比，模型组、美珍颗粒剂组及SASP组LPO含量均升高，组间比较有显著差异（P＜0.05），而美珍颗粒剂组及SASP组的LPO含量均较模型组明显下降，而美珍颗粒剂组尤为显著，组间比较有显著差异（P＜0.01）。

表2 各组红细胞SOD及结肠黏膜LPO含量比较（±s）

表2 各组红细胞SOD及结肠黏膜LPO含量比较（±s）

组 别 n SOD（U/mL） LPO（nmol/mg）正常组 20 37.35±1.22 1.51±0.21模型组 20 6.21±1.21 15.41±0.22 SASP 组 20 9.01±1.21* 9.11±0.22*美珍颗粒剂组 20 17.11±1.12**△ 6.11±0.22**△

2.4 UC大鼠治疗后肠黏膜周边组织血清IL-1β和IL-6的表达比较 见表3。与模型组IL-6和IL-1β相比，美珍颗粒剂组及SASP组IL-6和IL-1β均下降，组间比较有显著差异 （P＜0.05），美珍颗粒剂组治疗后IL-6和IL-1β因子表达进一步减弱，与SASP组相比有明显差异（P＜0.01）。

表3 各组治疗后IL-6和IL-1β表达比较（%，±s）

表3 各组治疗后IL-6和IL-1β表达比较（%，±s）

组 别 n IL-6 IL-1β正常组 20 13.42±0.62 13.31±0.53模型组 20 126.21±2.12 216.12±0.22 SASP 组 20 67.33±2.11* 118.31±0.21*美珍颗粒剂组 20 19.22±2.02**△ 25.31±0.21**△

2.5 UC大鼠治疗后肠黏膜周边组织NF-κB的表达比较 见表4。与正常组的NF-κB相比，模型组、美珍颗粒剂组及SASP组NF-κB均上升，组间比较有显著差异（P＜0.05），美珍颗粒剂组治疗后NF-κB因子表达进一步减弱，与SASP组相比有明显差异（P＜0.01）。

表4 各组治疗后NF-κB表达比较（%，±s）

表4 各组治疗后NF-κB表达比较（%，±s）

组 别 n NF-κB正常组 20 4.21±0.32模型组 20 28.33±2.01*SASP 组 20 18.11±2.01*美珍颗粒剂组 20 8.61±2.01**△

3 讨 论

近年来，用中医辨证论治中药口服结合灌肠治疗的报道很多，但因为服用、操作不便，临床应用受限。中医学认为UC总属泄泻范畴，以大肠湿热下注、气滞血瘀或阴（血）虚肠燥为主要病机特点，以腹泻、黏液脓血便、腹痛为主症。本研究针对其病机和主证，将南昌大学第一附属医院黄国栋博士的验方——美珍颗粒剂应用于UC，取得了快速的止血、镇痛、消炎、收敛的作用，具有很好的抗UC效果。

本实验研究发现，造模大鼠经治疗，结肠黏膜光镜下组织学有明显改变，结肠损伤分数、大便乳酸含量降低，SOD升高，LPO降低，与模型组比较，有显著差异（P＜0.05）。美珍颗粒剂组治疗后NF-κB，IL-6，IL-1β因子表达进一步减弱，与SASP组相比有明显差异（P＜0.01）。因此笔者认为美珍颗粒剂发挥抗UC的机制之一可能与其减弱NF-κB，IL-6，IL-1β的表达，降低结肠黏膜LPO含量，增加红细胞SOD含量，进而增加机体对O2-的清除，达到促进大便乳酸排泄，减少结肠炎症损伤有关。此项研究为美珍颗粒剂抗UC提供理论依据，为中药新药的筛选和开发提供理论基础。

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［6］于树玉.肿瘤宿主全血清中脂质过氧化水平动态变化及抗氧剂对其影响［J］.中国医学科学院学报，1984，6（5）：420.