舒郁散对慢性应激抑郁大鼠行为及海马BDNF表达的影响*

陈利平 王发渭 孙志高 黄泉智 柯清林

（1.解放军总医院海南分院，海南 三亚 572004；2.解放军总医院学员队，北京 100853）

舒郁散具有抗抑郁作用，可调节大脑神经递质、神经肽以及海马5-HT受体表达而发挥抗抑郁作用［1-2］。本研究选用慢性不可预见的应激抑郁模型，观察舒郁散对模型大鼠行为的影响，以及对海马脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白表达的影响，以期为抑郁症的临床治疗提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组 60只Wistar大鼠，体质量180～220 g，解放军总医院医学实验动物中心提供，动物号为SCXK-京-2009-0007。大鼠先用Open-Field法作行为学评分［3］，选择得分相近的50只大鼠随机分为正常对照组、模型组、百忧解组（20 mg/次）、舒郁散小剂量组（含生药0.5 g/mL）、舒郁散大剂量组（含生药5.0 g/mL），每组10只。正常对照组每笼饲养5只，其他组每笼饲养1只。

1.2 药物与试剂 舒郁散处方由中国人民解放军总医院中医科提供，由柴胡、枣仁、郁金、栀子等组成，上药浸泡、煎煮，过滤，于80℃恒温水浴中浓缩成含生药量5 g/mL药液，存冰箱备用，使用时蒸馏水稀释灌胃；百忧解胶囊，礼来苏州制药有限公司分装，批准文号：国药准字2006017。BDNF（批号：909083W）北京博奥森生物技术有限公司产品。二抗显色试剂盒为En Vision Detection Kit基因科技 （上海）有限公司产品（Code No：GK500705）。全自动真空脱水机（LEICAASP300）、组织包埋机（LEICAEG1140H）、石蜡切片机（LEICARM2135）、展片机（LEIC-AHI1210）均为德国LEICA公司产品。光学显微镜为日本OLYMPUSBX60显微镜。APES防脱玻片、PBS缓冲液、柠檬酸盐缓冲盐、3%H2O2为北京中杉金桥生物技术有限公司产品。

1.3 模型制备 对大鼠进行21 d应激刺激，包括：摇晃5 min，禁水 24 h、禁食 24 h、夹尾 1 min，电击足底（每次 10 s，间隔1 min），冰水游泳 5 min，噪音刺激、转换昼夜节律 24 h，制动，热刺激40℃ 5 min。连续造模和给药21 d，每日上午给药，下午给予相应刺激［4］，制得慢性不可预见性应激抑郁大鼠模型。

1.4 糖水消耗实验 在造模前1日及造模第22日进行糖水消耗实验。实验时所有大鼠均单笼饲养，每只大鼠加1%蔗糖溶液100 mL，同时所有大鼠进行禁食，计算大鼠4 h饮用1%蔗糖溶液的量。

1.5 强迫游泳测试 强迫游泳试验在慢性应激3周后进行（9：30至11：30），把大鼠放在一个盛有高40 cm水（温度24～26℃）的透明玻璃容器（高25 cm，直径14 cm）被迫游泳。每只大鼠单独测试，按照预先设计顺序安排各组进行游泳测试，保证各组间测试时间无偏倚。在每次测试（6 min）中，记录后4 min大鼠的不动时间。

1.6 标本采集与检测 参照《大鼠脑立体定位图谱》［5］对大鼠海马组织取材，常规脱水，浸蜡包埋，切片捞于APES防脱玻片上，60℃烤片4 h，常规二甲苯脱蜡，过梯度酒精，PBS（0.01 mol/L pH 7.2-7.4） 浸洗 2 min×3，3%H2O210 min，PBS 浸洗 2 min×3，浸入柠檬酸盐缓冲液（0.01 mol/L pH6.0）微波热修复后，滴加一抗 BDNF（浓度为 1∶300），阴性对照组加 0.01 mol／L PBS 代替一抗，4℃冰箱孵育过夜，室温复温30 min后PBS浸洗5 min×3后滴加非生物素二抗，湿盒中室温30 min，PBS浸洗5 min×3，DAB显色光镜下控制时间，常规脱水，透明，封片。采用Imageproplus5.1图像分析系统测定每张照片的平均光密度值，每张切片同一部位取五个不同的视野。

1.7 统计学处理 应用SPSS12.0统计软件进行数据统计分析、统计学处理，结果以（±s）表示，主要统计学方法采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠糖水消耗量及强迫游泳不动时间比较 见表1。与正常对照组相比，模型组大鼠糖水消耗量、强迫游泳不动时间显著减低（P＜0.01）；大剂量舒郁散、百忧解能明显增加抑郁大鼠糖水消耗量，与模型组比，有显著差异（P＜0.05）。大剂量舒郁散能明显缩短抑郁大鼠游泳不动时间，与模型组比，有显著差异（P＜0.05）；百忧解也能明显缩短大鼠游泳不动时间，与模型组比有显著差异（P＜0.05）。

表1 各组大鼠糖水消耗量及强迫游泳不动时间比较（±s）

表1 各组大鼠糖水消耗量及强迫游泳不动时间比较（±s）

与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05。下同。

第1日 第22日正常对照组 10 87.74±16.48 88.23±15.42 104.34±16.37模型组 10 85.44±17.16 58.37±12.64*174.26±27.62*百忧解组 10 89.71±15.26 79.46±17.37△ 121.14±21.45△舒郁散大剂量组 10 86.38±16.72 82.87±16.68△ 118.31±19.52△舒郁散小剂量组 10 90.21±14.28 72.62±15.14 146.73±18.66组 别 n 糖水消耗量 强迫游泳不动时间

2.2 各组大鼠海马BDNF阳性表达平均光密度值比较 见表2。光镜下可见BDNF的阳性细胞主要集中于海马CA1和CA3区锥体细胞和DG颗粒细胞层。阳性表达位于海马神经元细胞胞胞浆中，正常对照组大鼠海马神经元核呈圆形，大而清晰、核仁明显、排列整齐；模型组海马中BDNF阳性表达较正常对照组面积小，胞浆着色浅，平均光密度值比较差异有统计学意义（P＜0.05）。舒郁散大剂量组、百忧解组大鼠海马BDNF阳性细胞表达比模型组面积更大、颜色更深，两组平均光密度值与模型组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。舒郁散小剂量组阳性表达虽有增强，与模型组比较差异无统计学意义。

表2 各组大鼠海马BDNF阳性表达平均光密度值比较（±s）

表2 各组大鼠海马BDNF阳性表达平均光密度值比较（±s）

组 别 n BDNF正常对照组 10 187.28±65.67模型组 10 102.45±47.75*百忧解组 10 168.17±55.38△舒郁散大剂量组 10 173.42±58.74△舒郁散小剂量组 10 156.23±51.49

3 讨 论

本课题通过采用慢性不可预见性应激抑郁模型，该模型可模拟抑郁症的核心症状，即兴趣丧失、快感缺乏、运动能力、探索行为能力及性行为能力等下降；其抑郁状态持续时间长符合实验研究要求。当前国外许多学者采取液体消耗实验中糖水的消耗量和糖水偏爱百分比作为测量快感缺乏的有效指标［6］。行为学实验在筛选具有抗抑郁活性的药物方面发挥着重要的作用。实验研究中，造模后大鼠糖水消耗量降低，说明模型组动物活动减少、兴趣丧失、食欲减退，而百忧解及舒郁散大剂量可增加慢性应激抑郁大鼠糖水的消耗量。通过观察动物在不可逃避性应激状态下，因绝望致不动时间的改变可反映药物的抗抑郁效应，强迫游泳实验是常用的绝望动物方法［7］，大剂量舒郁散能明显增加抑郁大鼠糖水消耗量以及强迫游泳不动时间，具有抗抑郁的作用。

BDNF的表达增加有利于促进神经元存活、生长和分化成熟，上调海马突触可塑性，被认为可能是各种抗抑郁剂治疗的共同作用机制［8］。BDNF主要分布于中枢神经系统大脑内，以海马、皮质、屏状核等脑区的分布为高，研究表明BDNF对胆碱能神经元、多巴胺能神经元、运动神经元、γ-氨基丁酸能神经元的存活和生长，对延缓神经元的变性和自然死亡，均具有很好的生物活性作用；研究已经发现抑郁症患者海马部位及前额叶皮层部位BDNF水平明显减少［9］。本实验研究结果显示：经过21 d慢性应激刺激后模型组大鼠海马组织的BDNF的阳性表达降低与正常对照组比较差异显著；中药大剂量舒郁散和百忧解组够显著提高海马组织BDNF的阳性表达，这提示舒郁散抗抑郁的药理可能是通过提高海马组织BDNF的表达来起作用。本实验结果与Taliaz［10］文献报道相似。

抑郁症属于中医学“郁证”，其发病大多是由情志所伤，肝失疏泄，肝气郁结，气机不和所致，病变部位初期在肝，随着肝郁气滞、气机失和，日久则伤及心、脾二脏，或为心火，或肝郁犯脾。因此，治疗抑郁症实证以疏肝理气解郁为主，虚证宜养心健脾安神。本研究采用具有疏肝理气、养心解郁功效的中药舒郁散治疗，结果表明大剂量舒郁散可以改善慢性应激抑郁大鼠行为，其作用可能与增加海马BDNF蛋白表达有关，上述作用与其剂量呈正相关。舒郁散具有调理心肝、疏肝理气、养心解郁之功效，本方对治疗抑郁症具有较好的疗效，其他文献也有报道［11-12］。本研究仅观察舒郁散对慢性应激抑郁大鼠行为、海马BDNF蛋白表达变化进行研究，抑郁证的发病机理较为复杂，有关舒郁散的作用机理还有待于进一步的研究。

［1］陈利平，孙艳，王发渭，等.舒郁散对慢性应激抑郁大鼠神经肽及海马神经元 5-HT 表达的影响［J］.南方医科大学学报，2011，31（1）：113-116.

［2］Yuanyuan Zhang，Jianjun Jia，Liping Chen，et al.Effects of Shuyusan on monoamine neurotransmitters expression in a rat model of chronic stress-induced depression［J］.Neural Regeneration Res，2011，6（33）：2582-2588.

［3］刘荣焱，李晓华，秦利民，等.甘麦大枣汤加味治疗自杀未遂后抑郁临床体会［J］.中国中医急症，2008，17（11）：1599.

［4］Alessia Bachis1，Alessandra Malleil.Chronic antidepressant treatments increase basic fibroblast growth factor and fibroblast growth factor-binding protein in neurons［J］.Neuropharmacology，2008，55（7）：1114-1120.

［5］包新民，舒斯云.大鼠脑立体定位图谱［M］.北京：人民卫生出版社，1991：48-51.

［6］许晶，李晓秋.慢性应激抑郁模型的建立及其评价［J］.中国行为医学科学，2003，12（1）：14-17.

［7］Willner P.Validity，reliability and utility of the chronic mild stress model of depression：a 10-year review and evaluation［J］.Psychopharmacology，1997， 134（4）：319-329.

［8］Friedman B，Kleinfeld D，Ip NY，et al.BDNF and NT-4 ／5 exert neurotrophic influences on injured adult spinal motor neurons［J］.Neurosci，1995，15（2）：1044-1056.

［9］D Taliaz， N Stall.Knockdown of brain-derived neurotrophic factor in specific brain sites precipitates behaviors associated with depression andreducesneurogenesis［J］.MolecularPsychiatry，2010，（15）：80-92.

［10］D Taliaz，N Stall，DE Dar.BDNF in schizophrenia，depression and correspondinganimal models［J］.Molecular Psychiatry，2005，（10）：345-352.

［11］陈利平，王发渭，段冬梅.舒郁散治疗抑郁症的临床研究［J］.中国中医急症，2009，18（10）：1583-1584.

［12］孙志高，陈利平，王发渭.舒郁宁心中药治疗卒中后抑郁临床研究［J］.中国中医急症，2011，20（7）：1033-1034.