小鼠异位节段性胰腺移植模型

薛亮 陈辉 严盛 郑树森

胰腺移植是当前治疗胰岛素依赖型糖尿病的一种有效手段，能实现血糖长期稳定，延缓和改善晚期并发症的发生［1-3］。缺血再灌注损伤是胰腺移植后最显著的非免疫性并发症，其发生率达35%［4］，是导致移植胰腺功能不全甚至急性失功的重要因素。2007年，Maglione等［5］报道了小鼠颈部袖套法胰腺移植模型技术，该模型可以用于胰腺缺血再灌注损伤方面的研究。在此模型的基础上，我们试图建立一种新的套管技术小鼠异位节段性胰腺移植模型，为胰腺缺血再灌注损伤方面的实验研究提供条件。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用雄性BALB/c小鼠12对(体质量20～25 g，上海实验动物研究所提供)。所有动物实验操作均依据浙江大学动物保护指导方针，符合美国国立卫生研究院“实验动物保护和使用指南”要求。

1.2 胰腺移植手术

实验小鼠采用1%戊巴比妥钠麻醉(1 mL/100 g体质量)，仰卧固定后放置于温度维持在35.5～37.0℃的加热垫上。热缺血时间计时点由供体手术中血管钳夹闭胸主动脉起至UW液经腹主动脉灌注胰腺止。冷缺血时间计时点由供体手术中UW液经腹主动脉灌注胰腺起至受体手术中除去微型血管夹、移植胰腺恢复血供止。供、受体手术过程均尽量避免对胰腺的触碰。

1.2.1 供体手术

沿供体小鼠腹壁前正中线切开进腹，小鼠腹腔专用拉钩撑开固定，充分暴露手术视野。以两根消毒棉签将空肠、回肠、升结肠及右侧横结肠推向小鼠腹部左侧(图1A)，可发现近似平行的肠系膜上动脉和腹腔干。钝性分离肠系膜上动脉、腹腔干及腹主动脉，肠系膜上动脉下方留置一段6-0丝线。仔细解剖肝门部，结扎并切断胆总管和肝动脉，钝性分离门静脉。在靠近胃上极处结扎并切断食管和胃短动脉，双次结扎并切断胃左动脉。结扎肠系膜上动脉(图1B)。钝性分离小鼠膀胱上方下腔静脉和腹主动脉，经下腔静脉注射1%肝素钠溶液0.3 mL。打开小鼠胸腔，以血管钳夹闭胸主动脉，切断上、下方下腔静脉，5 mL注射器抽取1 mL UW液经腹主动脉灌注胰腺。灌注完毕后可见胰头与胰体尾部间分界线(图1C)，结扎并切断胰头及主胰管，剔除胃和十二指肠部分。在尽可能靠近肝门处切断门静脉，获得较大的门静脉开口。切断肠系膜上静脉，结扎并切断膀胱上方腹主动脉，在腹腔干与腹主动脉交叉点上方0.5 cm处切断腹主动脉，确保没有小的分支血管。结扎连接胰体尾部和脾脏的血管，保留脾脏切取胰腺，保存于4℃ UW液中(图1D)。

图1 供体手术

1.2.2 受体手术

沿受体小鼠右侧颈部纵向切开，钝性分离皮肤下方组织，以4个小夹子撑开，充分暴露手术视野。切除右侧下颌下腺以获取更多空间，于上、下极结扎胸锁乳突肌并横断。游离右侧颈总动脉和右侧颈外静脉，结扎并切断分支。使用微型血管夹阻断近端右颈总动脉和右颈外静脉，保留足够长度用以安装套管，结扎并切断远端右颈总动脉和右颈外静脉，以少量肝素钠溶液冲洗血管内壁并取出全部血栓。近端静脉和动脉分别采用外径为0.94 mm和0.63 mm的聚乙烯套管(英国Portex公司)。将断端血管末端外翻完整包绕套管，以10-0丝线结扎固定(图2)。

图2 供体颈部血管套管

1.2.3 胰腺植入

供体小鼠节段性胰腺置于受体小鼠右侧颈部，位置摆放正确以防止血管扭曲引起血栓。将受体小鼠右侧颈总动脉套管塞入供体胰腺腹主动脉(图3A)，受体小鼠右侧颈外静脉套管塞入供体胰腺门静脉(图3B)，均以7-0丝线结扎固定。依次除去静、动脉微型血管夹，观察移植胰腺血供状况及吻合口是否出血，准备少许明胶海绵及小棉球防止吻合口出血(图3C)。切除脾脏，观察移植胰腺15～20 min。为避免移植胰腺暴露于空气中，防止干燥，可在移植胰腺表面覆盖湿润的细纱布，并不断用37℃乳酸林格液湿润。受体小鼠股静脉注射0.3 mL生理盐水以补充术中液体丢失。术后立即予保温灯加热照射受体小鼠至移植后2 h，同时给予食物和水。

1.3 观察指标

手术成功率、手术时间、热缺血时间、冷缺血时间、微循环。

图3 胰腺植入过程

2 结果

共完成小鼠颈部异位节段性胰腺移植手术12例。11例移植手术成功(术后2 h时受体小鼠存活)，成功率92%。动、静脉套管内无血栓形成，血流良好，无吻合口出血。1例移植手术因胰腺植入过程中未完成套管连接导致大出血失败。供体小鼠手术持续时间(40±5)min(35～45 min)，受体小鼠颈部分离时间(20±5)min(15～25 min)，套管连接时间5～10 min。供体小鼠胰腺热缺血时间小于5 min，冷缺血时间(40±5)min(35～45 min)。

移植术后2 h，受体小鼠尾静脉注射荧光染料(0.4%异硫氰酸荧光素，0.3 mL/只)，荧光显微镜下观察10 min，可见移植胰腺微循环血供丰富(图4)。

图4 荧光显微镜下可见移植胰腺微循环血供丰富(×320)

3 讨论

胰腺移植的动物模型经历了从狗等大型动物到小型动物大鼠、进而到小鼠的过程。Lee等［6］首次报道了大鼠的胰腺移植模型。Tori等［7］改进并建立了小鼠胰十二指肠移植模型，但是存活率仅为46%。相对于大鼠器官移植模型，小鼠器官移植模型有其特有的优势:近交系小鼠在我国易获得;转基因小鼠技术成熟;实验成本低，可作大样本研究［8］，尤其是价值昂贵的新型免疫抑制剂及生物制品的研究。但小鼠器官移植模型对操作者的显微外科技术有较高的要求。

Maglione等［5］建立的小鼠颈部袖套法胰腺移植模型，其供体胰腺是完整胰腺组织。我们在该模型的基础上进行了改进。(1)基于胰头部胰腺组织动脉供血主要源自肠系膜上动脉，而胰体尾部胰腺组织动脉供血主要源自腹腔干，因此在供体手术中，将腹腔干和肠系膜上动脉双动脉全胰腺移植改为单腹腔干节段性胰腺移植，摸索出新的小鼠胰腺移植模型。选取长度适中的腹腔干行血管重建，尽可能避免湍流形成，减少血栓形成概率，获得稳定的血流动力学，保证移植胰腺的血供。(2)受体手术中，尽可能剔除颈部静脉血管壁外脂肪组织，有利于受体静脉套管安装，同时减少脂肪组织堆积阻塞套管内部空间而引起的狭窄。小鼠颈总动脉直径约为0.13～0.15 mm，动脉套管的安装是本手术的难点。我们选用个体较大的小鼠作为受体，同时于颈总动脉分叉处切断，获得尽可能大的开口，提高受体动脉套管安装成功率。胰腺植入过程中，供、受体之间的血管连接是整个手术成败的关键所在，需要选择合适的套管材质和直径尺寸。因此，我们采用Portex公司的聚乙烯套管，静脉套管外径为0.94 mm，动脉套管外径为0.63 mm。由于受显微镜视野和方向的限制，胰腺植入手术中血管连接套扎时只能看到正面的血管壁和套扎丝线，套扎前需要在下方安置7-0丝线，从下往上结扎。需要两位手术人员勤加练习，提高配合默契程度。(3)在整个手术中，尽量避免触碰供体胰腺，减少术中摩擦、触碰胰腺组织而引起的胰腺炎。

相对于其他小鼠胰腺移植模型而言，我们采用该套管技术速度快，减少冷缺血时间，重建后血栓形成和出血的概率小;将腹腔干和肠系膜上动脉双动脉全胰腺移植改为单腹腔干节段性胰腺移植，可以避开胰头与十二指肠部分的分离，一定程度上降低了显微操作难度。总之，借助套管技术，小鼠颈部异位节段性胰腺移植模型可以为胰腺缺血再灌注损伤方面的实验研究提供条件。

1 Sutherland DE，Gruessner R， Kandswamy R， et al. Beta-cell replacement therapy(pancreas and islet transplantation)for treatment of diabetes mellitus:an integrated approach［J］.Transplant Proc，2004，36(6):1697-1699.

2 Giannarelli R，Coppelli A，Sartini M，et al.Effects of pancreaskidney transplantation on diabetic retinopathy ［J］.Transpl Int，2005，18(5):619-622.

3 Lipshutz GS， Wilkinson AH. Pancreas-kidney and pancreas transplantation for the treatment of diabetes mellitus［J］.Endocrinol Metab Clin North Am，2007，36(4):1015-1038;x.

4 Fernández-Cruz L，Sabater L，Gilabert R，et al.Native and graft pancreatitis following combined pancreas-renal transplantation［J］.Br J Surg，1993，80(11):1429-1432.

5 Maglione M，Hermann M，Hengster P，et al.A novel technique for heterotopic vascularized pancreas transplantation in mice to assessischemia reperfusion injury and graft pancreatitis［J］.Surgery，2007，141(5):682-689.

6 Lee S， Tung KS， KoopmansH， etal. Pancreaticoduodenal transplantation in the rat［J］.Transplantation，1972，13(4):421-425.

7 Tori M，Ito T，Matsuda H，et al.Model of mouse pancreaticoduodenal transplantation［J］.Microsurgery，1999，19(2):61-65.

8 Niimi M.The technique for heterotopic cardiac transplantation in mice:experience of 3000 operations by one surgeon［J］.J Heart Lung Transplant，2001，20(10):1123-1128.