头穴丛刺法对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力和HIF-1ɑ表达的影响

王春霞 许娜 王雅青 徐军 孙远征

（1黑龙江中医药大学附属第二医院针灸三病房，哈尔滨150001；2黑龙江中医药大学，哈尔滨150040）

头穴丛刺法对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力和HIF-1ɑ表达的影响

王春霞1许娜2王雅青2徐军2孙远征1

（1黑龙江中医药大学附属第二医院针灸三病房，哈尔滨150001；2黑龙江中医药大学，哈尔滨150040）

目的通过观察头穴丛刺法对慢性脑缺血大鼠学习记忆能力和HIF-1α表达的影响，探讨头穴丛刺治疗慢性脑缺血的作用机制。方法26只大鼠采用改良的双侧颈总动脉永久性结扎法（2VO）制备慢性脑缺血模型，造模成功的大鼠分为假手术组（A组）、模型组（B组）和头穴丛刺组（C组）。C组采用头穴丛刺法，A组和B组不予治疗。术后8周采用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆能力；免疫组化法检测额叶皮层、海马HIF-1α蛋白表达。结果术后8周B组和C组逃避潜伏期和游泳路程均明显延长，跨越平台次数明显减少，与A组相比具有显著性差异（P＜0.05）；但C组与B组相比，逃避潜伏期和游泳路程明显缩短，跨越平台次数增加，差异显著（P＜0.05）。免疫组化A组偶见HIF-1α阳性细胞表达，B组和C组均可见HIF-1α表达增高，与A组比较差异显著（P＜0.05)；C组较B组表达升高，差异显著（P＜0.05)。结论头穴丛刺能够明显改善大鼠的学习记忆功能，其可能通过促进HIF-1α表达来提高大鼠的学习记忆能力。

头穴丛刺；慢性脑缺血；学习记忆能力；HIF-1α

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组选用健康雄性Wistar大鼠26只（由黑龙江中医药大学动物实验中心提供），体重（180±30）g。大鼠适应性饲养一周，采用Morris水迷宫训练5d，剔除游泳能力差的大鼠，随机分为假手术组（A组）8只和手术组18只，手术组死亡2只。术后4周再通过Morris水迷宫试验检测大鼠学习记忆能力，造模成功的大鼠分为模型组（B组）和头穴丛刺治疗组（C组），每组8只。

1.2 模型制备参照Sarti[1]改良的双侧颈总动脉永久性结扎法（2VO）制备慢性脑缺血大鼠模型。10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射麻醉，保证手术期间有自主呼吸，取颈前部正中切口，钝性分离暴露左侧颈总动脉（CCA）后结扎该侧颈总动脉，逐层缝合，一星期后按照上面同样步骤结扎右侧颈总动脉后完成模型制作。假手术组仅分离暴露双侧CCA而不结扎。术后每日肌肉注射青霉素20万U/kg体重，预防感染，连续4d。

1.3 治疗方法模型组：不予任何治疗。头穴丛刺组：参照《实验动物穴位图谱》取大鼠的百会和百会左右旁开2mm三个穴位，大鼠头顶部常规剪毛消毒，用0.35mm ×25mm毫针从后向前平刺6～8mm，留针30 min，每15 min捻针一次，频率为200转/分左右，每次持续捻转3min，每日1次，共治疗4周。

1.4 Morris水迷宫试验包括定位航行试验和空间探索试验。定位航行试验以搜索持续时间（逃避潜伏期）和游泳轨迹（游泳路程）作为评价指标，大鼠找到平台所用的时间越长，在这期间走的路程越长，说明其学习记忆能力越差；空间探索试验以大鼠跨越平台次数代表学习记忆能力，跨越平台次数越少，大鼠的学习记忆能力越差。

1.5 标本的采集各组大鼠造模后8周以10%水合氯醛（300mg/kg）腹腔注射，麻醉生效后仰卧位固定，快速剪开胸腹腔，清晰暴露心脏和主动脉弓，剪开右心耳，速将输液器针头自心尖处通过左心室插入主动脉，快速灌注0.9%生理盐水约200m1，待液体从右心耳流出变清亮时，换用含4%多聚甲醛的0.1 MPBS（PH7.4）缓冲液200m1进行灌注固定，断头取脑，取以视交叉为中心相当于前联合连续脑片继续固定4～6h。常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，石蜡包埋，用切片机切成5μm薄片，贴于载玻片上。将做好的石蜡切片放置在56℃烤箱中烘烤2h，使石蜡切片和载玻片紧密粘附，防止脱片。存放于干燥避光处用于免疫组化染色检测。

1.6 免疫组化染色及结果判定免疫组化染色采用SP法，兔抗鼠HIF-1α抗体由武汉博士德公司提供。细胞质、胞浆内粉红色至棕黄色染色为阳性表达，应用人工计数法计算阳性细胞率，每张切片选取3个400×镜下视野计数阳性细胞数，以单个标本为单位，取平均值，最后统计阳性细胞占细胞总数的百分比。

2 结果

2.1 学习记忆能力检测

2.1.1 定位航行试验结果术后8周模型组和头穴丛刺组大鼠逃避潜伏期和游泳路程明显延长，与假手术组相比差异显著（P＜0.05），大鼠的学习记忆能力明显减退；头穴丛刺组与模型组相比，逃避潜伏期和游泳路程明显缩短，差异显著（P＜0.05），说明大鼠的学习记忆能力有所改善。见表1、表2。

表1 各组大鼠逃避潜伏期比较（±s,s）

表1 各组大鼠逃避潜伏期比较（±s,s）

注：与假手术组比较*P＜0.05，与模型组比较△P＜0.05

组别例数逃避潜伏期假手术组8 11.83±1.63模型组8 29.28±3.86*头穴丛刺组8 19.31±2.55*△

表2 各组大鼠游泳路程比较（±s,cm）

表2 各组大鼠游泳路程比较（±s,cm）

注：与假手术组比较*P＜0.05，与模型组比较△P＜0.05

组别例数游泳路程假手术组8 637.51±82.72模型组8 1381.16±137.24*头穴丛刺组8 1023.47±117.26*△

2.1.2 空间探索试验结果术后8周与假手术组相比，模型组和头穴丛刺组的跨越平台次数明显减少，具有显著性差异（P＜0.05）；但头穴丛刺组与模型组相比跨越平台次数增加，差异显著（P＜0.05），学习记忆成绩较模型组有明显提高。见表3。

表3 各组大鼠跨越平台次数比较（±s,次）

表3 各组大鼠跨越平台次数比较（±s,次）

注：与假手术组比较*P＜0.05，与模型组比较△P＜0.05

组别例数跨越平台次数假手术组8 6.38±0.92模型组8 2.75±0.31*头穴丛刺组8 4.88±0.63*△

2.2 免疫组化检测HIF-1ɑ结果免疫组化结果显示，HIF-1ɑ阳性蛋白表达为胞核、胞质内呈粉红色或棕黄色，额叶皮层、海马神经细胞、血管内皮细胞等均有表达。假手术组神经细胞数量、形态分布正常，偶见HIF-1ɑ阳性细胞表达。模型组和头穴丛刺组可见HIF-1ɑ表达增高，与假手术组比较差异显著（P＜0.05），而头穴丛刺组较模型组表达更高，差异显著（P＜0.05）。见表4，图1、2、3。

表4 各组大鼠额叶皮层、海马HIF-1ɑ阳性表达比较（±s）

注：与假手术组比较*P＜0.05，与模型组比较△P＜0.05

组别例数额叶皮层海马假手术组8 0.057±0.011 0.00±0.00模型组8 0.368±0.025*0.398±0.028*头针丛刺组8 0.561±0.045*△0.766±0.032*△

图2 模型组大鼠额叶皮层、海马HIF-1ɑ表达

图3 头穴丛刺组大鼠额叶皮层、海马HIF-1ɑ表达

3 讨论

大量研究表明，慢性脑缺血的病理机制十分复杂，是一个多基因和多靶点参与的过程，有多个病理生理环节参与，临床上主要表现为不同程度的认知功能障碍，最终导致持久性或进展性认知和神经功能障碍。孙莉等[2]已经证实2VO后大鼠额叶皮质及海马区脑血流量的减少，大鼠会出现进行性认知功能障碍。魏爱宣等[3]也通过Morris水迷宫实验检测2VO大鼠的学习记忆能力，证实了慢性脑缺血确实能够使大鼠出现明显的学习记忆障碍，并且随缺血时间的延长，学习记忆损害也呈进行性加重。2VO术后大鼠反应迟钝、行动缓慢、进食少、体重下降，但无明显肢体瘫痪等症状，与人类血管性认知功能障碍症状相近，因此2VO适合于研究慢性脑缺血致大鼠认知功能障碍。本实验采用了改进的2VO法，可大大降低动物的死亡率。

HIF-1α是一种氧依赖转录因子，在常氧条件下表达水平很低，低氧时HIF-1α就会呈指数式地大量增加[4]。研究已经证实HIF-lα为缺血、缺氧性损伤中最重要的信号转导途径之一[5]，诱导其下游多种靶基因表达，参与缺血、缺氧后血管生成、血管重塑、能量代谢、血管舒缩反应、细胞凋亡与增殖、红细胞生成等代偿过程，以保持机体氧稳态，具有重要的病理生理学意义。

头穴丛刺法是针灸专家于致顺教授依据传统中医经络理论，在相应的刺激区，采用“丛式”针刺（每区刺入3～5针，以覆盖病变部位为宜）进行治疗。头穴丛刺法以透经、透穴为特点，具有一经带多经、一穴带多穴的整合作用。这样的针刺方法从针刺部位上来说，使对头部的刺激由原来的点状刺激或线状刺激扩展到了面状刺激，增加了针刺的刺激面积。这样，在施用相同的针刺手法情况下，增加了刺激面积，也就是增加了刺激量，这是头穴丛刺法优于其它头针疗法的一个重要特点。

本研究结果说明双侧颈总动脉永久性结扎术后大鼠学习记忆能力下降，造成了慢性脑缺血性认知功能损害，头穴丛刺针灸治疗可以明显改善大鼠的学习记忆能力，减轻慢性脑缺血大鼠额叶皮层和海马的病理损害程度，故头穴丛刺对慢性脑缺血后认知功能下降大鼠的学习记忆功能及皮层、海马神经元的损伤具有保护作用，其可能通过上调HIF-1ɑ的表达从而促进了机体的代偿功能，发挥神经保护作用。

[1]孙莉,吴江,王守春.血管性痴呆大鼠脑血流量及细胞凋亡的研究[J].中华老年心脑血管病杂志,2001,3(6)∶409-411.

[2]魏爱宣,徐忠信.慢性脑缺血致认知障碍大鼠皮层HIF-1a、HO-1表达的变化[J].中国老年学杂志,2010,30(7)∶913-915.

[3]Lu LX,Lu H,Luo Y,et al.Stabilization of vascular endothelial growth factor mRNA by hypoxia inducble factor 1[J].Biochem Biophys Res Commun,2002,291(4)∶908-14.

[4]Fan LF,Diao LM,Chen DJ,et al.Expression of HIF-1 alpha and its relationship to apoptosis and proliferation in lung cancer[J].Cancer, 2002,21(3)∶254-71.

[5]Sarti C,Pantoni L,Bartolini L,et al.Cognitive impairment and chronic cerebral hypoperfusion∶What can be learned from experimental models[J]. Neurol Sci,2002,203-204∶263-266.

10.3969/j.issn.1672-2779.2012.14.043

：1672-2779（2012）-14-0061-02

：冯丽媛

2012-05-16）