饲粮添加共轭亚油酸对肉仔鸡肠道黏膜免疫反应的影响

刘永祥刘艳丽徐秋良姜东风杨建平

(1.河南省高校动物营养与饲料工程技术研究中心，郑州 450011;2.郑州牧业工程高等专科学校，郑州 450011)

共轭亚油酸(conjugated linoleic acid，CLA)是含有共轭双键亚油酸的空间和几何异构体的一类化合物的总称，属多不饱和脂肪酸家族的成员，具有抗癌、预防心血管疾病、糖尿病及控制体重等多种生理活性，其调节免疫和炎症反应的功效被广泛认可［1］。在动物生产方面，人们致力于生产富含CLA的动物产品以满足人类的健康需求，同时利用CLA的免疫调节作用，缓解畜禽免疫应激，保证畜禽正常生长。

肠道黏膜免疫是动物机体数量最大、最复杂的免疫系统，在对抗有害饲粮抗原和肠道病原微生物方面发挥着重要的作用。有研究表明，母鼠饲粮添加CLA能够提高幼鼠肠道分泌型免疫球蛋白 A(secretory immunoglobulin A，SIgA)含量［2］。从母猪怀孕至肉猪生长育肥期，在饲粮中添加CLA能够提高肉猪肠道SIgA含量，增强肠道细胞免疫功能［3］。在病原菌Brachyspira hyodysenteriae诱导仔猪肠炎的试验中，饲粮添加CLA能够增强仔猪结肠过氧化酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)基因mRNA的表达，缓解炎症相关的肠道黏膜损伤［4］。上述研究显示，CLA和肠道黏膜免疫反应存在密切的关系。在家禽科学方面，有关CLA的研究集中在提高禽产品的CLA含量及利用CLA改善机体脂类代谢从而提高肌肉率［5-7］，少量的研究涉及CLA对肉仔鸡的免疫调节特性［8-9］，但CLA对家禽肠道黏膜免疫反应的研究尚属空白。

基于CLA和猪鼠等动物肠道黏膜免疫的密切关系，我们推断CLA可能影响肉仔鸡肠道黏膜免疫反应。本试验参考前人的研究［8-9］，选择1%CLA添加量，研究CLA对肉仔鸡空肠SIgA分泌和小肠黏膜细胞免疫反应的影响，旨在为采取营养措施调控肉仔鸡的肠道免疫反应，保证肉仔鸡正常生长提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲粮

试验选用72只1日龄健康、体重相近的爱拔益加(AA)雄性肉仔鸡，随机分配到对照组和CLA组，每组6个重复，每个重复6只鸡，2组分别饲喂基础饲粮和在基础饲粮中添加1%CLA的饲粮。饲粮参考NRC(1994)标准配制，基础饲粮组成及营养水平见表1，CLA组以1%CLA替代等量豆油，试验所用的CLA(80.8%)购自青岛澳海生物有限公司。肉仔鸡购自本地孵化场，初始体重差别控制在1.5 g。采用3层镀锌鸡笼饲养，人工控温，最初5 d的温度控制在31～33℃，以后每周降低2～3℃。肉仔鸡饲养按常规程序饲养和免疫，直到21日龄。

1.2 样品采集与指标测定

1.2.1 生长性能

试验开始和结束时，以重复为单位分别称重，统计阶段平均日采食量和料重比，发生死亡时，随时记录饲料消耗量和死淘汰鸡的体重。

1.2.2 空肠内容物SIgA测定

肉仔鸡于21日龄宰杀，收集空肠内容物，内容物与生理盐水按1∶1(质量体积比)稀释，混匀后5 000×g 4℃离心15 min，分离上清液。按ELISA试剂盒说明测定SIgA含量，ELISA试剂盒购自上海沪峰生物科技有限公司。

1.2.3 空肠黏膜SIgA、PPARγ 和转化生长因子β4(transforming growth factor-β4，TGFβ4)基 因mRNA表达检测

取21日龄肉仔鸡空肠中段2～3 cm，纵形剖开，用磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤，取组织样30～50 mg，液氮速冻后，置入 -80℃保存。总mRNA分离采用TRIZOL一步法，即组织样品在1 mL TRIZOL中充分匀浆，匀浆液12 000×g 4℃离心10 min以去除不溶成分。

实时荧光PCR检测基因mRNA表达。各基因引物序列如下，根据GenBank发表的鸡PPARγ基因mRNA(XM414308)序列为模板设计引物为:5'-GGGCGATCTTGACAGGAA-3'，5'-GCCTCCACAGAGCGAAAC-3'。根据 GenBank发表的鸡SIgA基因mRNA(S40610)序列为模板设计引物为:5'-TAGATAACCTCGAGCCGATCGCA-3'，5'-GACTTGCCCTCCAATGGATCCTC-3'。根 据 Gen-Bank发表的鸡TGFβ4基因mRNA(M31160)序列为模板设计引物为:5'-CGGGACGGATGAGAAGAAC-3'，5'-CGGCCCACGTAGTAAATGAT-3'。根据GenBank发表的鸡 β-肌动蛋白(β-actin)基因mRNA(NM 205518)序列为模板设计引物为:5'-TCTGGTGGTACCACAATGTACCCT-3'，5'-CCAGTAATTGGTACCGGCTCCTC-3'。

表1 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table 1 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

PCR反应体系为:1 μL cDNA、上游和下游引物(0.25 μmol)各 0.6 μL、5.3 μL 双蒸水(无RNA 酶)、7.5 μL SYBR Green PCR master Mix(ABI公司，美国)，反应总体积为15 μL。扩增条件为:55℃ 2 min，94℃预变性10 min，94℃变性15 s、53.5 ℃退火30 s、72 ℃ 延伸 30 s扩增 30 个循环，每个样品设3个重复。以β-actin为参比。

1.2.4 Peyer氏结淋巴细胞分离、淋巴细胞转化率和淋巴细胞亚群检测

Peyer氏结及其淋巴细胞分离按照Vaughn等［10］的方法。截取从麦柯尔盲囊近端大约3 cm到回盲结合部尾端大约2 cm的肠段，用蒸馏水彻底冲洗，在靠近空肠和回肠结合处用镊子结扎，用10～20 mL稀薄的曙红液灌注，停留1 min，然后用10～20 mL结晶紫溶液灌注，显现并切除Peyer氏结，放入冷的RPMI-1640溶液，用手术刀片轻轻切割和碾碎，肠道组织转移到含10 mmol/L DTT、10-4mol/L EDTA的无钙、镁汉克氏平衡盐溶液(CMF-HBSS，含5%胎牛血清)中，37°C孵育，摇床20 min，释放的淋巴细胞经300目尼龙网过滤，500×g离心，沉淀悬于HBSS液，反复3次。重悬于HBSS液(含3%胎牛血清)，用Percoll密度离心法分离IEL，4℃，600×g，离心25 min，重悬于HBSS营养液，调整淋巴细胞至1×107个/mL。

MTT法测定淋巴细胞转化率。将淋巴细胞悬液加入96孔细胞培养板，再加入含丝裂原伴刀豆球蛋白(ConA，终浓度45 μg/mL)，对照组则加等体积的不含丝裂原的培养液，培养体系每孔共200 μL，3 个重复。于5%CO2、37 ℃ 下培养72 h。在培养结束前4 h，每孔加入5 mg/mL的 MTT 10 μL，继续培养。培养结束时，每孔再加入100 μL 10%SDS-0.04 mol/L HCl溶液，30 min 后用酶标仪于570 nm波长下测定OD值。

淋巴细胞亚群检测。CD4+和CD8+淋巴细胞亚群含量在河南省人民医院采用流式细胞仪测定。小鼠抗鸡CD4+-PE、CD8+-PE(Southern Biotechnology Associates，Inc，Birmingham，AL)单抗均为荧光标记。

1.3 统计分析

试验数据表示为平均值±标准差，采用SPSS 11.5统计分析软件进行t检验和相关分析。

2 结果

2.1 生长性能

如表2所示，CLA组和对照组肉仔鸡1～21日龄的平均日增重、平均日采食量和料重比之间没有显著差异(P＞0.05)。

表2 饲粮添加CLA对1～21日龄肉仔鸡平均日增重、平均日采食量和料重比的影响Table 2 Effects of dietary CLA on average daily gain，average daily feed intake and feed/gain of broiler chicks from 1 to 21 days of age

2.2 空肠食糜 SIgA含量和空肠 SIgA基因mRNA的表达

从表3可以看出，与对照组相比，CLA组肉仔鸡空肠食糜SIgA含量和空肠SIgA基因mRNA的表达水平分别提高了 43.58%(P＜0.01)和212.20%(P ＜0.01)，这说明饲粮粮添加 CLA 无论在蛋白质水平还是在基因水平上均提高了SIgA的表达。

表3 饲粮添加CLA对肉仔鸡空肠食糜SIgA含量和空肠SIgA基因mRNA表达的影响Table 3 Effects of dietary CLA on jejunal chyme SIgA content and jejunum SIgA gene mRNA expression of broiler chicks

2.3 空肠PPARγ和TGFβ4基因mRNA的表达

从表4可以看出，与对照组相比，CLA组肉仔鸡空肠PPARγ基因mRNA表达水平提高了51.56%(P ＜0.01)，但 TGFβ4 基因 mRNA 表达水平在2组之间没有显著差异(P＞0.05)。

表4 饲粮添加CLA对肉仔鸡空肠PPARγ和TGFβ4基因mRNA表达的影响Table 4 Effects of dietary CLA on jejunum PPARγ and TGFβ4 gene mRNA expression of broiler chicks

2.4 Peyer氏结淋巴细胞转化率和淋巴细胞亚群

饲粮添加CLA对肉仔鸡Peyer氏结淋巴细胞亚群和淋巴细胞转化率的影响见表5。与对照组相比，CLA组肉仔鸡Peyer氏结CD8+淋巴细胞亚群百分数提高了 18.35%(P ＜0.01)，CD4+淋巴细胞亚群百分数有提高的趋势，但未达到显著水平(P＞0.05);饲粮添加 CLA显著提高肉仔鸡Peyer氏结淋巴细胞增殖活性(P＜0.05)。

表5 饲粮添加CLA对肉仔鸡Peyer氏结淋巴细胞亚群和淋巴细胞转化率的影响Table 5 Effects of dietary CLA on T lymphocyte subsets of Peyer’s patch and lymphocyte transformation rate of broiler chicks

3 讨论

3.1 饲粮添加CLA对肉仔鸡生长性能的影响

在本试验的条件下，饲粮添加1%CLA对1～21日龄肉仔鸡平均日增重、平均日采食量和料重比均没有显著的影响，这与 Du等［11］和 Simon等［12］的研究结果一致。但 Szymczyk 等［13］发现在肉仔鸡饲粮中添加 CLA(0.50%、1.00% 和 1.50%)显著降低了平均日采食量和平均日增重，但对料重比无显著影响。而贺喜等［6］的研究表明饲粮添加1.00%CLA显著增加长沙黄和AA 2个品种肉仔鸡1～21日龄和22～42日龄期间的体增重并改善4～6周龄的饲料转化率。不同试验结果的差异还没有明确的解释，但可能与CLA添加水平、饲喂时间和动物的营养状态、品种等因素有关。

3.2 饲粮添加CLA对肉仔鸡空肠SIgA分泌的影响

SIgA是胃肠道提供免疫保护最主要的免疫球蛋白，是黏膜免疫的核心，由于其独特的分泌成分可降低对蛋白酶的敏感性，保证其黏膜免疫清除功能的充分发挥，从而阻止外源蛋白和病原微生物的入侵。本试验首次报道饲粮添加1%CLA无论在蛋白水平还是在基因水平均提高了肉仔鸡空肠 SIgA 含量。Pérez-Cano等［2］报道，通过在母鼠饲粮中添加CLA，可提高仔鼠小肠和结肠SIgA基因mRNA表达水平和肠道SIgA含量。RamÍrez-Santana等［14］报道，小鼠饲粮长期添加 CLA可提高肠系膜淋巴结特异性卵清蛋白-免疫球蛋白A(OVA IgA)的产量。总之，饲粮添加CLA可能对多种动物肠道黏膜SIgA的分泌有广泛调节作用。

过氧化酶体增殖物激活受体(PPAR)是核受体家族中的一员，是调控基因转录和细胞功能的一个重要成分，与特定的DNA序列即PPAR反应元件(PPRE)结合，调控目的基因的表达。目前的理论认为，CLA具有PPAR激活体的一般结构特点，激活PPAR是CLA发挥免疫调节和炎性抑制活性的途径之一［15］。在诱导性结肠炎(IBD)试验中，饲粮添加CLA通过激活PPARγ调节相关基因的表达，缓解仔猪炎性肠病损伤程度［16］。Nicholas等［17］报道，CLA通过PPAR途径减轻结肠炎症，阻止肠道肿瘤的形成。本试验中，饲粮添加CLA提高了空肠PPARγ基因mRNA的表达水平，同时也使SIgA含量和SIgA基因mRNA表达水平增强，这意味着激活PPARγ可能是CLA调节SIgA表达的途径之一。

转化生长因子β(TGFβ)在黏膜位点刺激免疫球蛋白A(IgA)反应中有重要的作用［18］，其介导的信号在免疫球蛋白M(IgM)+B细胞向IgA+B细胞转化中发挥重要作用。此外，TGFβ是吸引淋巴细胞向上皮层移居的趋化因子，在IgA+B细胞分化增殖后再到黏膜下固有层中成为成熟IgA浆细胞的过程中发挥重要作用。但本试验中该基因mRNA水平在CLA组和对照组之间没有显著差异，因此在本试验的条件下，提高的SIgA基因mRNA表达和蛋白质水平不可能源自TGFβ4的刺激作用。

3.3 饲粮添加CLA对肉仔鸡肠道细胞免疫的影响

Peyer氏结是肠道黏膜免疫系统重要的组分，是肠道对外界抗原应答的主要调节和扩大器，被称为第2淋巴器官。与哺乳动物的Peyer氏结不同，家禽的Peyer氏结在未固定的状态下不太明显，故其在黏膜免疫中的作用鲜有报道。本试验采用Vaughn等［10］提出的简便方法鉴别分离肉仔鸡的Peyer氏结。

本试验发现饲粮添加1%CLA显著提高21日龄肉仔鸡肠道Peyer氏结淋巴细胞对ConA的增殖活性。关于CLA对淋巴细胞转化率的影响已有许多报道。饲粮添加CLA增强鼠、猪等动物外周血和脾脏淋巴细胞的增殖活性［19-21］。但家禽方面的研究仅见于Zhang等［9］的报道，与本试验结果不同的是饲粮添加CLA显著提高了42日龄时外周血淋巴细胞对ConA的增殖反应，但对肉仔鸡21日龄外周血淋巴细胞转化率无显著影响。本试验与Zhang等［9］试验结果存在差异的原因可能在于淋巴细胞对CLA的反应存在组织差异性;此外，肠道直接处于高浓度的CLA环境下，可能比外周血淋巴细胞对CLA的反应更快。

本试验条件下，饲粮添加CLA显著提高Peyer氏结CD8+淋巴细胞百分数，与以前的研究结果一致，即在缺乏外源刺激的情况下，饲粮添加CLA能够提高鼠、猪和禽等动物外周血、胸腺、脾脏CD8+T 淋巴细胞数［9，20-22］。CD8+可直接破坏被病毒感染的细胞，防止由Th1和Th2类CD4+T淋巴细胞介导的免疫损伤，在机体抵抗病毒和细菌感染的细胞免疫中发挥重要的作用。因此，提高的Peyer氏结CD8+T淋巴细胞百分数意味着可能有助于提高肉仔鸡抵抗肠道病毒(菌)感染的能力，但其确切的作用尚需进一步的攻毒试验来验证。不过这一作用已在猪的研究中得到证实:在肠道病原菌B.hyodysenteriae诱导仔猪肠炎的试验中，饲粮添加CLA有利于维持正常的淋巴细胞亚群(CD4+和CD8+)并减轻肠道黏膜损伤［4］。

4 结论

①饲粮添加1%CLA无论在蛋白质水平还是在基因水平均提高了21日龄肉仔鸡空肠SIgA含量，激活PPARγ可能是CLA调节SIgA表达的途径之一。

②饲粮添加1%CLA提高了21日龄肉仔鸡Peyer氏结T淋巴细胞转化率和CD8+T淋巴细胞百分数。

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