吡咯烷二硫代氨基甲酸对脂多糖致急性肺损伤大鼠NF-κB P65蛋白表达的影响

王红嫚 薛关生 万义增 王 健 臧东钰 (辽宁医学院附属第三医院呼吸科，辽宁 锦州 200)

急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)可引起顽固性低氧血症，病死率极高，发病机制复杂，缺乏有效治疗措施〔1〕。核转录因子-κB(NF-κB)是启动众多炎症介质基因转录的关键性因子，能够与DNA结合，几乎存在于体内所有细胞。在脂多糖(LPS)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等激活剂的刺激下，NF-κB进入细胞核与DNA特定的κB序列结合，使炎性介质和细胞因子基因转录增强，在炎症反应过程中发挥重要作用〔2〕。目前发现，ALI存在NF-κB激活，在ALI/ARDS中起着重要作用，控制NF-κB的活化可能成为治疗ALI/ARDS的关键环节。为此，本文通过观察LPS致大鼠ALI时肺组织胞质、胞核中P65蛋白变化及NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氢基甲酸(PDTC)对P65蛋白分布的影响，进一步探讨PDTC对ALI的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组及模型制备 54只300～350 g健康雄性Wistar大鼠，随机分为三组。对照组6只，ALI组(L组)24只;PDTC干预组(P+L组)24只;ALT组和PDTC干预组分别于腹腔注射LPS后1、2、4、8 h作为观测时间点。在各不同观测时间点取10%盐酸氯胺酮溶液(50 mg/kg)腹腔注射麻醉。

1.2 方法

1.2.1 细胞质和细胞核核蛋白的提取 制模后，取右肺中、下叶肺组织约100 mg，用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)充分洗涤，加入核蛋白提取裂解缓冲液 A 1.5 ml，冰上放置15～30 min，用电动匀浆器制成匀浆后加入500μl 10%NP-40，涡旋10 s，4℃、12 000 r/min离心30 s，上清即为细胞质蛋白。将沉淀物用冷PBS洗涤一次，4℃、12 000 r/min离心30 s，弃上清。加入1.5 ml核蛋白提取裂解液B，冰上放置30 min，然后4℃、12 000 r/min离心2 min，吸出上清(核蛋白)，Bradford比色法测定核蛋白浓度，并调至0.5～1.0μg/μl，置于-70℃保存。

1.2.2 Western印迹半定量检测NF-κB p65 20μg蛋白，10%聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭，一抗4℃过夜，二抗室温1 h，增强化学发光法(ECL)显色。将免疫印迹所得结果经图像扫描分析，以积分灰度值(IDV)表示P65相对含量。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行分析，数据用±s表示，组间比较采用t检验。

2 结果

将对照组胞质P65蛋白的IDV设为1，用其他各组P65蛋白的IDV与其的比值作为相对表达强度。结果显示:ALI组各时相肺组织胞质中NF-κB P65蛋白的表达强度较对照组显著降低(P＜0.01)而胞核中P65蛋白表达强度较对照组显著升高(P＜0.01);但PDTC干预组与ALI组比较，肺组织胞质中P65蛋白的表达强度较对照组升高(P＜0.05)，而胞核中P65蛋白表达强度较ALI组降低(P＜0.05)。见表1，图1。

图1 不同时相肺组织胞质、胞核NF-κB P65蛋白表达变化

3 讨论

研究表明，ALI存在着 NF-κB 激活，NF-κB 可使 TNF-α 等炎性介质的转录最大化;活化后参与许多基因的转录调控，在感染、炎症反应、氧化应激、细胞凋亡等病理过程中发挥重要作用。它是由P50、P52、P65、c-Rel、RelB 五种亚单位组成的同源或异源二聚体，发挥主要生理功能的是P50/P65异源二聚体，其中NF-κB P65为其主要亚单位。通常状态下，蛋白以二聚体形式与IκB抑制蛋白(NF-IκB)直接结合形成三聚体复合物 ，以非活性形式存在于细胞质中。在LPS等激活剂的刺激下，IκB抑制蛋白降解，使NF-κB进入细胞核与DNA特定的κB序列结合，其中P50与DNA结合有关，P65则因含有转录活化区域负责转录激活。本研究发现ALI组各时相肺组织胞质中P65蛋白的表达强度较对照组显著降低，而胞核中P65蛋白表达强度较对照组显著升高。说明P65蛋白在ALI/ARDS的发生和发展中起着重要作用，控制NF-κB的活化可能成为治疗ALI/ARDS的关键环节。

PDTC是NF-κB的特异性抑制剂，可调节NF-κB活化，控制致炎细胞因子的表达，具有抗氧化、抗细菌、真菌及抗肿瘤等特性〔3，4〕。研究发现，PDTC 通过抗氧化作用阻碍抑制蛋白 IκB从NF-κB复合体上解离，从而抑制NF-κB活化，阻碍NF-κB的P65、P50亚基向细胞核转移，使细胞核中的表达明显减少，在转录水平上抑制TNF-α、白介素-1等炎性细胞因子的产生〔5〕;还可直接降低NF-κB与DNA结合能力，干扰NF-κB激活的信号通路〔6〕。本研究发现，PDTC干预组与ALI组比较，肺组织胞质中P65蛋白的表达强度较ALI组升高，而胞核中P65蛋白表达强度较ALI组降低。因此，通过抑制NF-κB的活化来控制炎性介质的过度释放，可拓展临床治疗ALI/ARDS的新路径。

1 中华医学会重症医学分会.急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征诊断与治疗指南2006〔J〕.中华内科杂志，2007;46(5):430-5.

2 徐 娴，孙士其.重症急性胰腺炎核因子-κB及炎症介质与肺损伤的实验研究〔J〕.医学临床研究，2003;20(2):84-7.

3 邓朝胜，王 辰，庞宝森，等.中性粒细胞在肺血栓栓塞症犬肺缺血-再灌注损伤中的作用〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2006;29(9):603-60.

4 Hart SP，Dransfield I，Rossi AG.Phagocytosis of apoptotic cells〔J〕.Methods，2008;44(3):280-5.

5 Bellas RE，FitzGerald MJ，Fausto N，et al.Inhibition of NF-κB activity induces apoptosis in murine hepatocytes〔J〕.Am J Pathol，1997;151(4):891-6.

6 Li YQ，Zhang ZX，Xu YJ，et al.N-Acetyl-L-cysteine and pyrrolidine dithiocar-bamate inhibited nuclear factor-kappaB activation in alveolar macrophages by different mechanisms〔J〕.Acta Pharmacol Sin，2006;27(3):339-46.