局部注射LPS对慢性牙周炎模型大鼠牙髓、修复性牙本质形成的影响

(青岛大学医学院附属医院，山东青岛266003)

脂多糖(LPS)对牙周炎及牙髓炎发病的作用已有较多研究，然而慢性牙周炎状态下，LPS对牙髓组织的作用，鲜见报道。2011年5月～2012年1月，我们通过局部注射LPS建立慢性牙周炎大鼠模型，观察LPS对牙髓细胞生物活性以及修复性牙本质形成的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物和主要试剂 SD大鼠20只，雄性，体质量250～300 g。大肠杆菌标准内毒素 LPS(Sigma，USA)，用双蒸水稀释至2 mg/mL，过滤除菌后制成LPS溶液备用。

1.2 实验方法

1.2.1 牙周炎动物模型的建立 将大鼠以10%水合氯醛(3 mL/kg)行腹腔麻醉，取仰卧位，将四肢及上颌固定于手术板上。以75%乙醇消毒口腔，大鼠以左侧上颌磨牙为对照侧，右侧上颌磨牙为实验侧。分别在实验侧上颌第1、2磨牙之间颊腭侧自龈沟注射2 mg/mL的LPS各0.1 mL，隔天重复注射，3次/周，直至处死动物前。每周观察实验侧与对照侧牙龈颜色及充血状况，并拍X线牙片观察牙周炎形成情况。

1.2.2 模型大鼠牙周、牙髓状态及修复性牙本质形成的观察 造模第3、5周分别随机处死6只大鼠，迅速分离上颌骨，甲醛固定;去除牙周软组织后，用精确到0.05 mm的游标卡尺测定第1、2磨牙颊侧近中、正中、远中及舌侧近中、正中、远中6个位点的牙槽骨吸收值，取平均值。另8只大鼠于造模第3、5周处死，每次4只，迅速分离上颌骨，甲醛固定;10%硝酸脱钙8 h，乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，矢状面5μm厚连续切片;切片铺于多聚赖氨酸包被的玻片上，行HE染色，光学显微镜下观察并拍照。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。数据比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

大鼠对照侧牙龈组织呈粉红色，无充血水肿，无炎症性改变，牙龈无萎缩，X线检查牙槽骨无吸收。实验侧牙龈轻微红肿，探诊易出血，去除软组织后可见牙槽骨吸收;造模第5周时，X线检查大鼠牙槽骨吸收明显，牙槽嵴顶消失，硬骨板模糊不清;牙槽骨吸收超过根长1/3，但未超过根长1/2。大鼠对照侧与实验侧磨牙牙槽骨吸收值比较，见表1。

表1 大鼠对照侧与实验侧磨牙牙槽骨吸收值比较(mm，±s)

表1 大鼠对照侧与实验侧磨牙牙槽骨吸收值比较(mm，±s)

注:与正常侧比较，*P ＜0.05，△P ＜0.01;与同侧第 1磨牙比较，#P ＜0.05

上颌磨牙牙槽骨吸收值造模第3周 造模第5周磨牙实验侧 0.95 ±0.11*0.97 ±0.05* 1.95 ±0.10△1.55 ±0.10*#第1磨牙 第2磨牙 第1磨牙 第2 0.27 ±0.05 0.28 ±0.05 0.28 ±0.05 0.29 ±0.04正常侧

造模第5周，病理切片发现大鼠实验侧牙周袋形成，牙槽骨破坏呈陷窝状吸收，牙槽骨内可见多处破骨细胞，牙槽嵴顶吸收低平。成牙本质细胞减少，排列紊乱，发生空泡性变;炎症细胞浸润，可见修复性牙本质形成;牙本质小管弯曲，数目减少，有些区域甚至不含小管。

3 讨论

3.1 牙周炎模型的建立 牙周病是由G－菌引起的慢性感染性疾病，LPS是G－菌细胞外膜的主要成分，其对牙周组织有很高的毒性。牙周感染时细菌内毒素及多种炎性因子诱导破骨细胞活化、增殖，抑制成骨细胞活性，牙槽骨代谢平稳失调，是引起牙槽骨吸收的主要因子，可直接和间接导致牙槽骨吸收［1，2］。LPS不仅自身能导致骨吸收，还可作为一个促进因子，与其他骨吸收因子产生协同效应，使其骨吸收能力得以加强［3，4］。由于LPS具有高度保守性，活性基本一致，而大肠杆菌的LPS结构与伴放线放线杆菌结构类似［5］，致病性基本一致，所以本实验选用大肠杆菌的LPS代替牙周致病菌建立模型。

本实验采用2 mg/mL的LPS来建立牙周炎动物模型，第3周时即形成牙周炎动物模型，可见牙龈轻微红肿，探诊出血，牙槽骨开始破坏吸收;第5周时，X线片显示牙槽骨吸收明显，超过根长1/3但未超过根长1/2。该病程进展慢于其他研究，可能由于药物浓度、处理方式等差异造成。本研究结果发现，第5周对照侧与实验侧牙槽骨吸收值有统计学意义，证明单纯用LPS注射法建立牙周炎模型是可行的。第5周时实验侧第1磨牙比第2磨牙吸收明显，可能因为第1磨牙位置靠前、利于注射，或者大鼠咀嚼以第1磨牙为主等原因所致。同时，本研究用X线确定牙槽骨吸收的方法，与人类临床判断牙周炎的方法相似，形成的牙周炎模型牙槽骨吸收明显，更接近于人类牙周炎的临床发病状态。

3.2 LPS对牙髓、修复性牙本质形成的影响 研究表明，LPS直接作用牙髓组织，可导致粒细胞、血小板向血管内皮细胞黏附，血小板凝集，出现弥漫性血管内凝血(DIC)等血液循环系统障碍［6］;同时，LPS对细胞周期有抑制作用，可以抑制细胞增殖，影响牙髓细胞的损伤修复［7］。侯本祥等［8］报道，用 5 mg/mL的LPS开髓直接暂封，1周后成牙本质细胞减少，根管壁周围有少量修复性牙本质形成;2周后冠部牙髓部分坏死，仍可见炎细胞浸润;髓腔周围有牙本质小管较少的修复性牙本质形成，以根管内最为显著。然而本实验观察到，LPS局部注射形成牙周炎时，与LPS直接刺激牙髓时的反应相类似。

牙齿在受到龋坏、机械、化学损伤、感染、磨损等多种刺激后，牙髓组织都会有修复反应［9］。牙周炎时牙周袋内的LPS及其刺激产生的细胞因子，可以通过根尖孔、根管侧支和牙本质小管，对牙髓和牙本质造成慢性、小量的刺激，引起修复性牙本质的形成。炎症可能是修复过程中潜在的关键因素。炎症事件激活干(祖)细胞释放细胞因子，炎症细胞或者牙髓成纤维细胞进行表型转化为成骨细胞/成牙本质样细胞，形成修复性牙本质。修复性牙本质既可能是牙髓自身修复的反应，也可能是一种牙髓刺激反应［10］。

综上所述，本实验用局部注射内毒素LPS的方法成功构建了牙周炎动物模型，并观察到了成牙本质细胞的空泡性变及修复性牙本质形成等，这为研究牙周所致牙髓病变的发病机制提供了重要的实验模型。

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