槲皮素对肾癌786-0细胞增殖、凋亡的影响及其机制探讨

(辽宁医学院第一附属医院，辽宁锦州121001)

近年来研究发现，槲皮素对多种恶性肿瘤具有良好的抗癌功效，而在抗肾癌方面的相关报道较少。2010年3月～2011年9月，我们观察了槲皮素对肾癌786-0细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 肾癌786-0细胞购自中国科学院上海生化细胞所细胞库，并经传代培养至对数生长期;槲皮素，用 DMSO溶解配制成原液，－20℃保存;MTT，Annexin V/PI染色试剂盒，磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Akt及 β-actin;细胞培养箱(NAPCO MODEL5410)，低温高速离心机(Ependorff，美国)，流式细胞测定仪(Becton-Dickinson，美国)。

1.2 方法

1.2.1 槲皮素对786-0细胞增殖影响的观察 采用MTT法。取对数生长期的细胞，以2×103/孔接种96孔板，培养24 h;待细胞贴壁后，观察组分别加入终浓度分别为10、25、50、100μmol/L的槲皮素，对照组加入1‰的DMSO，每组设3个复孔。分别于培养24、48、72 h后，加入5 mg/mL的 MTT 10μL;培养4 h后弃去培养液，加入0.1 mL DMSO;待结晶完全溶解后，在Bio-Rad550酶联免疫检测仪上以570 nm和630 nm双波长测定每孔的吸光度(A)值。细胞增殖抑制率=(1－观察组A值/对照组A值)×100%。

1.2.2 槲皮素对786-0细胞凋亡影响的观察 采用流式细胞术。细胞接种同1.2.1，待细胞贴壁后，观察组加入终浓度分别为10、25、50μmol/L槲皮素，对照组加入1‰的DMSO，每组设3个复孔。培养48 h后，收集各组细胞，加入适量PBS，2 000 r/min离心5 min，弃上清，重复2次。加入500μL的Binding Buffer悬浮细胞，再加入5μL Annexin V混匀后，加入5μL PI，混匀;室温、避光反应15 min后，1 h内上流式细胞仪检测，计算细胞凋亡率。

1.2.3 槲皮素对786-0细胞p-Akt及总Akt蛋白表达影响的观察 细胞接种、分组及处理同1.2.2，培养48 h后，收集各组细胞，采用Wester blot法检测，按说明书进行。p-Akt(总Akt)表达量=［(实验组p-Akt(总 Akt)/实验组 β-actin］/［对照组 p-Akt(总Akt)/对照组 β-actin］。

1.2.4 统计学方法 采用SPSS11.5统计软件。组间比较用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 槲皮素对786-0细胞增殖的影响 槲皮素对肾癌786-0细胞的生长抑制作用呈现明显时间及剂量依赖性(P 均 ＜0.05)，见表1。

2.2 槲皮素对786-0细胞凋亡的影响 对照组及观察组经10、25、50μmol/L的槲皮素处理后，786-0细胞凋亡率分别为 3.16% ±1.78%、13.4% ±3.87%、22.38% ± 2.44%、34.42% ± 5.37%，观察组细胞凋亡率与对照组相比明显增加(P均＜0.05)，且随剂量升高而增加。

表1 槲皮素对肾癌786-0细胞增殖抑制率的影响(±s)

表1 槲皮素对肾癌786-0细胞增殖抑制率的影响(±s)

槲皮素(μmol/L)细胞增殖抑制率(%)24 h 48 h 72 h 10 88.95 ±3.14 85.41 ±4.78 75.47 ±6.31 25 77.73 ±6.67 64.53 ±5.75 37.56 ±7.75 50 70.72 ±6.58 51.86 ±4.12 24.83 ±8.56 100 66.51 ±8.79 44.98 ±4.67 19.87 ±6.55

2.3 槲皮素对786-0细胞内p-Akt和总Akt表达的影响 10、25、50μmol/L的槲皮素处理48 h后，786-0细胞 p-Akt蛋白相对表达量分别为0.92±0.05、0.54 ±0.06、0.33 ±0.04，总 Akt蛋白相对表达量分别为1.03 ±0.08、0.93 ±0.12、0.54 ±0.06。不同浓度槲皮素处理后786-0细胞内p-Akt表达水平比较，P 均 ＜0.05。

3 讨论

槲皮素是一种天然黄酮类化合物，广泛分布于植物、食物及中草药之中。近年来研究表明，槲皮素具有调控多种肿瘤细胞增殖和凋亡的作用。王旭等［1］将体外培养的卵巢癌HO-8910细胞用不同浓度的的槲皮素处理，发现槲皮素能抑制HO-8910细胞的增殖，并呈时间和剂量依赖性(P均＜0.05)。赵旭林等［2］研究发现，槲皮素可显著抑制肝癌HepG2细胞生长，并能诱导肿瘤细胞发生凋亡，提示诱导凋亡为槲皮素抑癌的机制之一。马朋等［3］研究发现，槲皮素对人宫颈癌Hela细胞增殖有明显的抑制作用，且呈浓度和时间依赖性。经槲皮素作用48 h后，AO/EB双重染色可见细胞呈凋亡样改变;槲皮素作用Hela细胞24、48 h后，与对照组相比线粒体膜电位下降，此结果提示槲皮素能体外抑制人宫颈癌Hela细胞生长，诱导细胞凋亡。另外研究［4，5］发现，槲皮素能显著抑制人鼻咽癌 CNE2 细胞、乳腺癌MCF-7细胞增殖，促进其凋亡。槲皮素抗肿瘤作用具有选择性，对正常细胞的毒性微弱［6］，因此是一种较为理想的抗肿瘤药物，其制剂已进入Ⅰ期临床研究阶段［7］。本研究结果表明，槲皮素能够有效地抑制肾癌786-0细胞增殖，其抗肿瘤作用主要是通过诱导肿瘤细胞凋亡而实现的。

关于槲皮素诱导肿瘤细胞凋亡的机制，目前尚不清楚。研究表明，PI3K/Akt通路是细胞内调控增殖与凋亡的重要传导通路。其中Akt位于PI3K的下游，活化后可磷酸化其下游靶蛋白，进而促进一系列细胞生长相关基因的转录，引起细胞快速增殖［8］。庞瑞萍等［9］研究发现，吲哚美辛可能通过Akt信号通路诱导胃癌细胞MGC-803的凋亡。张敏等［17］应用脱氧核酶抑制Akt表达，发现Akt脱氧核酶对MCF-7乳腺癌细胞在体外的生长具有抑制作用。Hara等［11］研究发现，与正常肾组织相比，肾癌组织中p-Akt表达显著升高，提示应用Akt抑制剂可诱导肾癌细胞发生凋亡。本研究发现，786-0细胞在静息状态下即存在PI3K/Akt通路的活化，以槲皮素处理后PI3K/Akt通路活性明显下降，提示槲皮素可能通过抑制PI3K/Akt通路活性发挥对肾癌的抗肿瘤作用。下一步作者将使用大鼠进行体内实验，研究槲皮素对于体内实体肿瘤的抑癌作用。

［1］王旭，张爽.槲皮素对卵巢癌细胞HO-8910增殖的抑制作用及机制［J］.山东医药，2010，50(6):14-16.

［2］赵旭林，徐国昌，贺利民，等.槲皮素诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的作用［J］.实用心脑肺血管病杂志，2010，18(3):310-311.

［3］马朋，宋晓冬，闫苗苗，等.槲皮素诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡的作用［J］.解剖学杂志，2011，34(4):462-465.

［4］杨娜，朱开梅，顾生玖.槐米中槲皮素对人鼻咽癌CNE2细胞增殖与凋亡作用的研究［J］.时珍国医国药，2011，22(9):2215-2217.

［5］高薇，刘洪，孙静.槲皮素诱导人乳腺癌MCF-7细胞凋亡的实验研究［J］.齐齐哈尔医学院学报，2011，32(6):849-851.

［6］Cheng S，Gao N，Zhang Z，et al.Quercetin induces tumor-selective apoptosis through downregulation of Mcl-1 and activation of Bax［J］.Clin Cancer Res，2010，16(23):5679-5691.

［7］Mulholland PJ，Ferry DR，Anderson D，et al.Pre-clinical and clinical study of QC12，awater-soluble，pro-drug of quercetin［J］.Ann Oncol，2001，12(2):245-248.

［8］Carnero A.The PKB/AKT pathway in cancer［J］.Curr Pharm-Des，2010，16(1):34-44.

［9］庞瑞萍，胡品津，曾志荣，等.吲哚美辛通过Akt/GSK3β/NAG-1信号通路诱导胃癌细胞的凋亡［J］.中国病理生理杂志，2011，27(8):1513-1518.

［10］张敏，赵航，付强，等.脱氧核酶抑制Akt1基因对MCF-7乳腺癌细胞生长的影响［J］.医学分子生物学杂志，2011，8(4):323-326.

［11］Hara S，Oya M，Mizuno R，etal.Aktactivation in renal cell carcinoma:contribution of a decreased PTEN expression and the induction of apoptosis by an Akt inhibitor［J］.Ann Onco，2005，16(6):928-933.