大鼠慢性溃疡性结肠炎模型的建立及操作规范探讨*

孙晓萍，侯丽娟，王晓红，唐 方

（天津医科大学总医院中医科，天津 300052）

大鼠慢性溃疡性结肠炎模型的建立及操作规范探讨*

孙晓萍，侯丽娟，王晓红，唐 方

（天津医科大学总医院中医科，天津 300052）

[目的]建立大鼠慢性溃疡性结肠炎（UC）模型，探讨建立模型的操作规范。[方法]雄性Wistar大鼠，除正常对照（NC）组，其余大鼠用100mg/kg2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）/50%乙醇溶液建立溃疡性结肠炎急性模型，在造模10 d后，当所有模型大鼠便潜血转为“1+”时，随机抽取模型大鼠观察结肠病理组织学改变，剩余模型大鼠随机分为阳性对照（PC）组、UC组，用5%葡聚糖硫酸钠（DSS）水溶液或生理盐水进行致炎诱导结肠炎复发，造模后观察各组大鼠疾病活动指数（DAI），实验终点期处死观察结肠黏膜损伤指数（CMDI）及病理组织学改变。[结果]与正常对照组比较，慢性溃疡性结肠炎组饮DSS后再次出现结肠炎发作，DAI及CMDI评分明显增高（P<0.05），而阳性对照组逐渐好转；病理组织学改变亦有显著差异。[结论]采用TNBS/乙醇溶液首次致炎，用DSS间断进行诱导复发，可以模拟UC急性期与缓解期交替发作的特点，病理组织学改变与人类相似。

2，4，6-三硝基苯磺酸；葡聚糖硫酸钠；慢性溃疡性结肠炎；动物模型

慢性溃疡性结肠炎（UC）是一种病因不明的结肠和直肠炎性病变,临床表现为腹痛腹泻、黏液脓血便及不同程度的全身症状，呈现缓解复发交替出现的发病特点。近年来UC在中国发病总体呈现上升趋势，建立与之相类似的模型对于深入研究此疾病具有重大意义。目前，有多种用于UC研究的动物模型[1]，化学物诱导法如乙酸法、葡聚糖硫酸钠法、恶唑酮法等，免疫法如2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）法、二硝基氯苯法等，另还有免疫复合法、特定基因敲除、T细胞移植等模型，这些模型各具优势，但始终缺少UC缓解复发交替出现的变化。TNBS/乙醇模型以及5%葡聚糖硫酸钠（DSS）致UC模型以价廉又与人病变相似的优势成为炎症性肠病的经典模型被普遍应用，目前认为TNBS模型慢性缓解期持续时间较长，有文献表明人为反复运用DSS刺激，可诱导大鼠出现类似人类UC急性期与缓解期交替出现的变化，且病变与人类类似[2]，采两者之长联合应用探索UC慢性模型的建立，将为后续研究提供借鉴。

1 材料和方法

1.1 实验动物 SPF级雄性Wistar大鼠40只，体质量180～220 g，购自中国医学科学院，合格证号：SCXK（京）2009-0004。

1.2 主要器材及试剂 5%TNBS（批号：068k5001，美国Sigma公司），D SS（分子量5000，日本光和纯药株式会社，批号：STF2213 REFBMS622），无水乙醇（天津江天化工技术公司），便潜血（OB）试剂（珠海贝索生物技术有限公司），8号导尿管，1mL注射器。

1.3 造模方法

1.3.1 动物分组 将40只大鼠于清洁级动物饲养室适应性饲养3 d后，采用随机数字表法随机分为正常对照组10只、模型组30只。

1.3.2 模型制备 1）5%TNBS与50%无水乙醇以体积1∶1配成TNBS/乙醇混合液；DSS用蒸馏水配成5%DSS水溶液。2）大鼠禁食不禁水24 h，称质量，采用10%水合氯醛以3mL/kg剂量腹腔注射麻醉后，将8号导尿管轻轻插入肛门上端8 cm，以4mL/kg（相当于TNBS 100mg/kg）剂量，用1mL注射器缓慢注入相应体质量比例造模剂，模型组为TNBS，NC组为生理盐水，再注入0.5mL空气，倒立5min，仰卧归笼，保温灯照射至大鼠苏醒，自由饮食。实验第11天时模型大鼠便潜血已转为“1+”，随机抽取10只处死取结肠组织进行苏木—伊红（HE）染色，剩余模型大鼠随机分为PC组、UC组，进行诱导复发，UC组以5%DSS水溶液代替饮水自由饮用24 h，NC组及PC组则饮用生理盐水；实验第16天时模型大鼠便潜血又转为“1+”，再予DSS、生理盐水自由饮用24 h进行第3次致炎，实验第21天时处死取材。

1.4 观察指标

1.4.1 疾病活动指数（DAI） 自造模后第1天起，每日观察大鼠精神状态、活动、皮毛色泽、体质量、大便性状及便隐血状况。按表1进行评分[3-4]，见表1。

表1 DAI评分表Tab.1 DAIscore table

1.4.2 结肠黏膜损伤指数（CMDI） 剖取大鼠肛门至盲肠末端的结肠段，清理肠系膜及粘连组织，沿肠系膜纵轴剪开，冰生理盐水反复冲洗干净，平铺于滤纸上，参照文献[5-6]按表2立即进行肉眼大体黏膜损伤程度评分，见表2。

表2 CMDI评分表Tab.2 CMDIscore table 分

1.4.3 病理组织学观察 取大鼠结肠病变最明显处组织一小部分，用4%甲醛溶液固定，常规石蜡包埋切片，HE染色。

1.5 统计方法 应用统计软件SPSS 18.0处理数据，计量资料采用均数±标准差（±s）进行描述，两组正态分布计量资料组间比较采用t检验，多组正态分布计量资料组间比较采用单因素方差分析，两组及多组偏态分布计量资料组间比较采用秩和检验，P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠黏膜损伤指数（CMDI） 结果见表3。

表3 实验终期CMDI评分比较（±s）Tab.3 Com parison of CMDIscoreat the end of the experimen（t±s） 分

表3 实验终期CMDI评分比较（±s）Tab.3 Com parison of CMDIscoreat the end of the experimen（t±s） 分

注：与 NC 组比较，*P<0.01，**P<0.05；与 PC 组比较，△△P<0.05。

组别 n CMDI NC组 10 0 UC 组 10 4.56±1.74*△△实验第 11 天 10 6.13±1.86*△△PC 组 10 1.33±0.50**

2.2 疾病活动指数（DAI） 结果见表4、表5。

表4 TNBS致炎前10 d DAI评分比较（±s）Tab.4 Com parison of DAIscore ofeach group in the first ten days（±s） 分

表4 TNBS致炎前10 d DAI评分比较（±s）Tab.4 Com parison of DAIscore ofeach group in the first ten days（±s） 分

注：与NC组比较，*P<0.01。

组别 n 第2天 第4天 第6天 第8天 第10天NC组 10 0 0 0 0 0 TNBS 首次致炎 30 2.50±0.39*1.67±0.88*1.63±0.90*1.22±0.55*0.89±0.37*

2.3 组织病理学观察（光镜×100倍） 结果见图1～图4。

3 讨论

一般情况：应用TNBS造模后，模型大鼠均出现蜷卧少动，被毛松散，肉眼血便或黏液稀便，便次增多，体质量不同程度下降，约1周时间症状即有缓解，大便变实，便潜血阳性，体质量回增。诱导复发后，UC组又出现两次结肠炎发作，以稀薄血便、体质量下降为主要症状，复发高峰期在饮DSS当天及饮后1～2 d，PC组状态良好，体质量继续增长，便潜血逐渐减轻或转阴。正常对照组大鼠实验全程状态良好，大便正常，体质量增长。

表5 复发致炎后DAI评分比较（±s）Tab.5 Com parison of DAIscore after inflammation recurrence（±s） 分

表5 复发致炎后DAI评分比较（±s）Tab.5 Com parison of DAIscore after inflammation recurrence（±s） 分

注：与 NC 组比较，*P<0.01；与 PC 组比较，△P<0.01。

组别 n NC组 10 UC组 10 PC组 10第12天 第13天 第14天 第15天0 0 0 0 2.13±1.02*△ 1.53±0.95*△ 1.47±0.72*△ 1.27±0.77*△0.67±0.00* 0.67±0.01* 0.67±0.00* 0.67±0.01*第16天0 1.20±0.63*△0.70±0.11*第17天 第18天 第19天 第20天0 0 0 0 2.07±1.01*△ 1.13±0.55*△ 1.03±0.32*△ 0.87±0.36*△0.67±0.00* 0.67±0.00* 0.60±0.08* 0.13±0.28

表3 CMDI统计证实UC组大鼠结肠黏膜明显损伤（P<0.01或 P<0.05），而PC组结肠黏膜损伤趋近恢复，但未恢复到正常水平（P<0.01），仍处于TNBS致炎缓解期，这与目前认为TNBS致UC模型的缓解期持续时间较长一致。光镜下UC组组织病理与PC组、NC组相比可见溃疡、瘢痕，溃疡处黏膜缺失、纤维组织及小血管增生、渗出，炎细胞浸润，病变以黏膜和黏膜下层为主，而溃疡和炎细胞浸润正是评判溃疡性结肠炎模型成功的主要标准。隔日抽取大鼠DAI评分比较，如表4所示，应用TNBS致炎后模型大鼠DAI评分显著增高,结合图2病理表现证实：应用TNBS致炎成功，模型第11天时仍可见溃疡及炎细胞浸润。由表5提示，未予DSS刺激，PC组DAI评分逐渐好转，实验终期时与NC组相比未见显著差异，UC组大鼠给予DSS刺激后出现相应的DAI升高（P<0.01）。肉眼观察大鼠结肠黏膜发现，NC组大鼠色泽淡红，黏膜皱襞清晰完整，肠壁厚薄适中；TNBS造模第11天时可见糜烂、溃疡，部分大鼠伴肠粘连；UC组大鼠见溃疡、瘢痕、肉芽肿，病灶肠壁变厚，部分大鼠有肠粘连；PC组肠黏膜皱襞变浅，无明显溃疡。

实验发现规范实验各环节操作对于提高成模率十分必要，探讨如下。1）DSS间断给饮标准：正式建模前预实验证实大鼠每隔1日饮用1次DSS，实验终期大鼠死亡过半，推测因DSS具有和肝素同样的抗止血抗凝血作用，可导致严重的脱水和肝凝血机制损害，致动物失血过多死亡，其可能死因已被报道过[7]；而每隔至少4 d、大鼠便潜血已恢复为“1+”后再给饮则大鼠无死亡。因此，给饮DSS应以便潜血“1+”为度，每次给饮24 h，两次给饮间隔至少4 d。2）麻醉后保温：低温是麻醉常见的并发症，可导致药物代谢下降、抗感染能力下降等并发症。文献报道麻醉后采取保温措施能够缩短麻醉恢复时间，减少各种并发症的发生，降低麻醉风险[8-9]。实验在24℃室温使用水合氯醛常规3mL/kg体质量腹腔注射麻醉，高达10%的麻醉大鼠未苏醒死亡，采取保温大鼠可全部苏醒，提示保温是降低模型大鼠制备过程中因麻醉而死亡的重要因素，是提高成模率的关键环节之一。经此规范，将有效提高成模率。

以上结论表明，单用TNBS 1次致炎，约3周时间大鼠结肠大致愈合，而联合DSS在TNBS致炎后间断刺激，能诱导大鼠出现类似人类UC急性期与缓解期交替出现的变化，这是一般UC模型所不具备的。此模型以稀薄血便及体质量下降为主要症状，病变主要局限于结肠黏膜及黏膜下层，以溃疡和炎细胞浸润为主，与人类UC病变相似。该模型还具有制作简单，周期短，重复性好的优点，可作为平台用于深入了解UC的病因、发病机制，有助于药物在不同时期的介入研究以及中医中药辨证论治的探索，能满足一般模型不能满足的长期长效实验观察，对UC缓解复发的更深入探索研究具有重要价值。

[1]祁向争，刘 洁.溃疡性结肠炎动物模型研究进展[J].天津中医药大学学报，2010，29（4）：220-220.

[2]Osman N,Adawi D,Ahrne S,eta1.Modulation of the effectof dextran sulfate sodium-induced acute colitis by the administration of different probiotic strains of Lactobacillus and Bifidobacterium[J].Dig Dis Sci,2004,49(2):320-327.

[3]Steidler L,HansW,Schotte L,et al.Treatmentofmurine colitis by lactococcus lactis secreting interleukin-10[J].Science,2000,289(5483):1352-1355.

[4]陈 迟，冉志华，萧树东，等.普伐他汀对乙酸诱导大鼠结肠炎的治疗作用及其机制的研究[J].中华医学杂志，2006，86（18）：1284－1288.

[5]Butzner JD,Parmar R,BellCJ,etal.Butyrateenema therapy stimulatesmucsal repair in experimental colitis in the rat[J].Gut,1996,38(4):568-573.

[6]王 皓，欧阳钦，胡仁伟.三硝基苯磺酸结肠炎动物模型的建立[J].胃肠病学，2001，6（1）：7－10.

[7]杨富强，陈光明，吴乐园，等.葡聚糖硫酸钠诱导动物溃疡性结肠炎及其机制[J].天津医药，2000，28（1）：40－42

[8]蒋正英，喻永敏.术中低体温对实验动物模型麻醉恢复期的影响[J].临床合理用药杂志，2009，2（9）：11－12.

[9]严国锋，张 健，周 勇，等.保温措施对小鼠麻醉效果的影响[J].实验动物与比较医学，2008，28（5）：70－71.

Reproducing chronic ulcerative colitis in ratsand itsprocedure conform ity

SUNXiao-ping,HOU Li-juan,WANGXiao-hong,TANGFang
（TC M Department,GeneralHospitalof Tianjin MedicalUniversity,Tianjin 300052,Chin a）

[Objective]To reproduce chronic ulcerative colitis(UC)in rats and establish its procedure conformity.[Methods]MaleWistar ratswere random ly divided into normal control group andmodel group.Acute colitiswas induced by rectal administration of2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution(TNBS)dissolved in 50%ethanol,100mg/kg.Ten days later,when thestooloccultblood of ratsshowed“1+”,tenmodel ratswere random ly selected and killed to observe colon histologicalchanges;the othermodel ratswere random ly divided into positive(PC)group and(UC)group.The occurrence of colitiswas induced with drinking 5%dextran sulfate sodium(DSS)solution or normal saline.Aftermodeling the disease activity index(DAI)was observed in each group.The colonicmucosal damage index(CMDI)and the histological changeswere assessed et the end on experiment.[Results]Compared with normal group and positive group,DAI and CMDIscores of chronic ulcerative colitis group were significantly increased (P<0.05);the histological changeswere also differed significantly between them.[Conclusion]The chronic ulcerative colitiswas successfully reproduced in rats.Themethod ofusing TNBS/alcohol solution to induce inflammation firstand using DDS to induce its recurrence can imitate the characteristics of replaced onsetof acute and chronic stage in UCgroup.Ithassimilar pathological changes to that in human body.

2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid;dextran sulfatesodium;chronic ulcerative colitis;animalmodel

R574

A

1672-1519（2012）03-0270-04

天津市科技创新专项资金项目（06FZZDSH00405）。

孙晓萍（1986-），女，硕士研究生，主要从事中药药理及消化系统疾病研究。

唐 方。

2012-01-05）