辛伐他汀对大鼠急性肺栓塞的保护作用

2012-05-15靳建军陆慰萱

中华老年多器官疾病杂志 2012年7期

靳建军, 郭军, 陆慰萱

（1郑州大学第一附属医院呼吸与危重医学科, 郑州 450052; 2中国医学科学院北京协和医院呼吸内科, 北京 100730）

他汀类药物具有不依赖降脂作用的多效性, 能够发挥改善内皮功能、抑制炎症反应[1]、减轻氧化应激、增强纤溶活性[2]和抗血栓形成[3]等多种有益作用。近年研究证实, 他汀类药物能够降低静脉血栓栓塞症的发生风险[4,5], 减轻缺血性脑卒中引起的神经功能损害[6], 甚至可以降低肝硬化导致的门脉高压[7], 但他汀类药物对急性肺栓塞（acute pulmonary embolism, APE）的影响尚不清楚。鉴于内皮功能障碍、局部炎症反应、氧化应激、继发血栓形成等病理生理学异常在 APE的发病机制中扮演重要角色,我们推测, 他汀类药物有可能凭借其多效性而对APE产生保护效应。他汀类药物还能够激活NO-cGMP信号通路[8]、增加内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）的表达[9],由于激活NO-cGMP信号通路可以抑制APE引起的肺血管收缩和肺动脉压力增加[10,11], 因此, 我们设想，应用他汀类药物干预可能会减轻 APE所致的肺动脉高压，而对APE产生保护效应，并对此进行了初步探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

10周龄雄性Sprague-Dawley大鼠72只（购自北京维通利华实验动物有限公司）, 随机分为假手术组、肺栓塞模型组、辛伐他汀干预组, 每组24只。各组又随机分为2 h、6 h和24 h三个时间点, 每个时间点8只动物。

1.2 辛伐他汀干预及肺栓塞模型制备

在造模前 2周, 各组分别接受生理盐水和辛伐他汀干预: 假手术组和肺栓塞模型组生理盐水灌胃、辛伐他汀干预组辛伐他汀（10 mg/kg）灌胃，每日1次，连续14 d，第 13 d经左股动脉取血制备自体栓子，第14 d经左颈外静脉注入1.5 ml生理盐水。

1.3 实验数据采集及标本处理

右颈外静脉插管, 采用右心导管法测定平均肺动脉压（mean pulmonary arterial pressure, mPAP）和右心室收缩压（right ventricular systolic pressure, RVSP）;右颈动脉插管, 取动脉血0.1 ml, 行动脉血气分析。放血处死大鼠, 行胸部正中切口, 将左肺以 10%的甲醛溶液固定, 石蜡包埋切片, 苏木素-伊红（HE）染色, 观察肺组织病理学改变。免疫组织化学染色检测肺动脉eNOS蛋白的表达。Image-Pro Plus病理图像分析系统进行平均光密度（累积光密度值/面积）半定量分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS11.0软件对数据进行统计学处理, 组间比较采用t检验和单因素方差分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组动物造模后6 h动脉血气分析

肺栓塞模型组 6 h PaO2明显降低, 与假手术组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）; 辛伐他汀干预组 6 h PaO2与肺栓塞模型组比较明显升高（P＜0.05）, 但与假手术组比较仍明显降低（P＜0.05）。肺栓塞模型组6 h肺泡-动脉氧分压差（A-aDO2）明显增加, 与假手术组比较差异具有统计学意义（P＜0.01）; 辛伐他汀干预组6 h A-aDO2与肺栓塞模型组比较明显降低（P＜0.05）, 但与假手术组比较仍明显升高（P＜0.05）。肺栓塞模型组6 h二氧化碳分压（PaCO2）升高, 但与假手术组和辛伐他汀干预组比较差异无统计学意义（表1）。

表1 各组大鼠造模后6 h动脉血气结果Table 1 Arterial blood gas analysis of rats at 6 h after model establishment in different groups (n = 8, mmHg,±s)

注: PaO2: 氧分压; PaCO2: 二氧化碳分压; A-aDO2: 肺泡-动脉氧分压差。1mmHg=0.133kPa。与假手术组比较, *P＜0.05, **P＜0.01;与肺栓塞模型组比较, #P＜0.05

组别 PaO2 PaCO2 A-aDO2假手术组 90.51±5.63 42.07±8.84 9.18±3.68肺栓塞模型组 66.02±10.26** 51.68±10.14 34.52±11.75**辛伐他汀干预组 77.29±6.35*# 47.89±5.80 21.94±7.47*#

2.2 辛伐他汀对急性肺栓塞模型大鼠 mPAP,RVSP的影响

肺栓塞模型组大鼠不同时间点的 mPAP,RVSP均较假手术组明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。给予辛伐他汀干预后, 辛伐他汀干预组大鼠不同时间点的mPAP和RVSP与肺栓塞模型组比较显著降低, 差异具有统计学意义（P＜0.05）,但与假手术组比较仍明显升高, 差异具有统计学意义（P＜0.05; 表 2）。

表2 各组大鼠不同时间点mPAP和RVSPTable 2 mPAP and RVSP of rats at indicated time points in different groups (n = 8, mmHg,±s)

注: mPAP: 平均肺动脉压; RVSP: 右心室收缩压; 1mmHg=0.133kPa。与假手术组比较, *P＜0.05, **P＜0.01; 与肺栓塞模型组比较, #P＜0.05。

组别造模后2h 造模后6h 造模后24h 造模后2h 造模后6h 造模后24h mPAP RVSP假手术组 21.96±2.31 20.89±2.16 22.06±2.26 28.75±4.30 26.92±3.53 27.94±4.17肺栓塞模型组 31.19±3.70** 30.38±3.76** 30.22±3.01** 43.73±3.75** 43.43±4.42** 41.75±4.34**辛伐他汀干预组 26.53±2.46*# 25.54±2.39*# 26.10±2.65*# 38.32±3.46**# 37.36±5.35**# 36.57±3.25**#

2.3 辛伐他汀对急性肺栓塞模型大鼠肺组织eNOS表达的影响

肺组织免疫组化研究表明, eNOS蛋白阳性反应产物呈棕黄色, 主要分布于血管内皮细胞、支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞的胞浆中。造模后 6h, 肺栓塞模型组大鼠肺动脉 eNOS蛋白的平均光密度值较假手术组降低, 差异具有统计学意义（P＜0.01）;辛伐他汀干预组大鼠肺动脉 eNOS蛋白的平均光密度值较肺栓塞模型组组明显升高, 差异具有统计学意义（P＜0.05）, 但仍明显低于假手术组, 差异具有统计学意义（P＜0.01; 图1）。

2.4 辛伐他汀对急性 PTE大鼠血浆白细胞介素，肿瘤坏死因子α的影响

与假手术组大鼠比较, 肺栓塞模型组大鼠各时间点血浆白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）和肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平有升高趋势, 但差异无统计学意义（P＞0.05）。与肺栓塞模型组大鼠比较, 辛伐他汀干预组大鼠各时间点的血浆IL-6和TNF-α水平虽略有降低, 但差异无统计学意义（P＞0.05）。辛伐他汀干预组和假手术组大鼠比较, 各时间点的血浆 IL-6和 TNF-α浓度无明显差异（表 3）。假手术组、肺栓塞模型组24 h时间点的TNF-α水平均较2 h时间点明显升高, 差异具有统计学意义（P＜0.05）。辛伐他汀干预组不同时间点的TNF-α水平无明显差异。

图1 各组大鼠6 h时间点肺动脉eNOS蛋白表达的比较Figure 1 Expression of eNOS protein at 6 hours in different groups (n＝8)

表3 各组大鼠不同时间点血浆IL-6含量变化Table 3 Serum IL-6 and TNF-α level of rats at indicated time points in different groups (n = 8, ng/L,±s)

注: IL-6: 白细胞介素6; TNF-a: 肿瘤坏死因子a。与造模后2 h比较, *P＜0.05

组别造模后2 h 造模后6 h 造模后24 h 造模后2 h 造模后6 h 造模后24 h IL-6 TNF-α假手术组 58.67±10.33 63.69±10.83 69.76±14.03 44.89±11.55 57.48±10.79 73.19±16.22*肺栓塞模型组 71.31±9.34 74.09±16.26 86.36±10.91 58.28±12.95 64.49±13.94 92.55±32.54*辛伐他汀干预组 62.51±15.73 67.16±12.71 73.02±17.30 53.08±7.04 61.12±8.77 68.92±21.86

3 讨论

急性PTE常引起不同程度的呼吸功能障碍, 可表现为低氧血症和低碳酸血症。应用Rho激酶抑制剂[12]、西地那非[13]、NO[14]等药物能够减轻急性PTE时的低氧血症。本研究发现, 辛伐他汀干预能够增加急性PTE大鼠的动脉氧分压, 表明辛伐他汀可部分逆转急性PTE导致的氧合障碍。由于他汀类药物具有抑制Rho激酶的作用[15], 我们推测辛伐他汀改善低氧血症的机制可能与抑制Rho激酶信号通路有关, 一方面, 辛伐他汀可能通过抑制 Rho激酶松弛支气管平滑肌[16,17]、减轻支气管痉挛引起的通气受限; 另一方面, 辛伐他汀有可能抑制栓塞后血流再分布而改善通气血流比例失调。近期研究表明, 匹伐他汀干预可减轻脓毒症小鼠的急性肺损伤, 改善低氧血症[18]。因此辛伐他汀改善低氧血症的机制也可能与减轻急性PTE后的肺组织损伤有关。

有研究发现, 辛伐他汀腹腔注射3 d即可有效地降低野百合碱诱导的肺动脉高压大鼠和低氧性肺动脉高压大鼠的 PAP[19], 表明辛伐他汀具有较强的肺血管扩张作用。另有学者证实, 辛伐他汀具有内皮依赖性和非内皮依赖的急性血管扩张作用[20]。这促使我们设想, 应用辛伐他汀干预急性PTE有可能抑制神经体液机制激活引起的肺血管收缩, 降低肺血管阻力和肺动脉压, 减轻右心室后负荷而改善预后。本研究显示, 急性 PTE可引起右室收缩压和mPAP; 应用辛伐他汀干预能够减轻急性 PTE引起的肺动脉高压, 表明辛伐他汀具有选择性的肺血管扩张作用。因此, 辛伐他汀有可能成为血流动力学不稳定的APE患者的辅助治疗选择。

Toba等[12]应用聚苯乙烯微球体静脉注射诱导大鼠形成急性PTE, 发现急性PTE时eNOS蛋白表达下降, 同时伴有血浆内皮素 1水平升高, 表明急性PTE可引起内皮细胞功能障碍; 另有学者应用免疫组化和RT-PCR技术检测自体血栓急性PTE大鼠肺组织eNOS蛋白和mRNA表达, 发现急性PTE时肺组织eNOS蛋白和mRNA表达下降[21]; 但亦有研究认为, 急性 PTE时肺组织 eNOS表达无变化[22],甚至有研究认为, 急性PTE时eNOS表达增加[23,24]。上述各研究中肺组织 eNOS表达结果不一致, 可能与栓子性质、栓塞范围、测定时机等因素存在差异有关。本研究表明, 急性PTE时肺组织eNOS蛋白表达下降, 与多数文献报道一致。肺组织 eNOS蛋白表达下降可能与栓子引起的肺血管内皮细胞损伤有关。此外, 由于激活 Rho激酶信号通路能够抑制eNOS蛋白表达[25], 急性PTE引起的肺组织Rho激酶激活[12]可能也参与了 eNOS蛋白表达的下调过程。本研究结果还显示, 辛伐他汀干预可增加PTE大鼠肺组织 eNOS蛋白表达, 表明辛伐他汀能够改善急性PTE引起的内皮细胞功能障碍。辛伐他汀上调 eNOS蛋白表达的机制可能是通过抑制RhoA/Rho激酶信号通路[15], 导致eNOS mRNA的半衰期延长[9]。

本研究比较了各组大鼠不同时间点的血浆TNF-α水平变化, 未发现各组大鼠血浆TNF-α水平有明显差别。Eagleton等[26]应用微血管夹阻滞下腔静脉的方法诱导大鼠自体血栓形成, 48h后使血栓脱落形成肺栓塞, 研究发现急性PTE对肺动脉壁和肺组织TNF-α, IL-10水平无影响。Tsang等[27]将自体血凝块注入左下叶肺动脉, 导致猪形成急性 PTE,虽然肺动脉压明显增加, PaO2降低, 但血浆 TNF-α,IL-1β和IL-8水平变化不明显。结合上述研究结果,可以认为自体血栓急性PTE对血浆TNF-α水平无影响。本研究同时发现, 假手术组和肺栓塞模型组24 h时间点的TNF-α水平较2 h时间点明显升高, 但辛伐他汀干预组24 h时间点和2 h时间点的TNF-α水平无显著差别, 表明辛伐他汀能够抑制手术刺激引起TNF-α水平升高。

急性PTE时肺动脉壁和肺组织均存在明显炎症反应, 这些局部炎症反应可能与栓子溶解和内膜增生有关[26,28], 但全身炎症在急性PTE发病机制中的作用尚不清楚。有研究发现, 部分急性PTE患者血浆IL-6水平增加[29,30]。但这些患者常合并下肢静脉血栓形成, 而下肢深静脉血栓形成可引起血浆 IL-6水平升高[31], Dolci等[32]经肺动脉导管注入聚苯乙烯微球体诱导猪形成急性 PTE, 使肺动脉平均压加倍可引起低氧血症和右心室功能障碍, 尽管肺泡灌洗液蛋白质含量轻度增加, 但血浆 IL-6水平无升高。本研究发现, 与假手术组大鼠相比, 急性 PTE大鼠血浆IL-6水平无明显变化, 表明急性PTE引起的肺部炎症被局限化, 没有产生显著的全身效应。

总之, 辛伐他汀干预能够对急性PTE产生多方面的保护效应, 包括改善低氧血症、降低肺动脉压、恢复内皮细胞功能等, 因而有可能成为血流动力学不稳定的急性PTE的辅助治疗手段。

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