加味四逆散对睡眠剥夺大鼠PFC和海马CA3区NMDA受体表达的调节作用

范新六 李 峰 宋月晗 洪志强 马佳美 刘 燕

(1世界中医药学会联合会北京御方堂中医门诊部，北京市朝阳区小营路19号，100101;2北京中医药大学;3世界中医药学会联合会)

NMDA受体依赖性长时程增强(Long-term Potentiation，LTP)是突触可塑性的重要形式，而NMDA受体NR2亚基是其信号转导通路的关键环节;前额叶皮质和海马CA3区是参与学习与记忆的两个重要脑区。因此，本实验探讨睡眠剥夺大鼠前额叶皮质和海马CA3区与突触可塑性关系密切的NMDA受体NR2亚基(含磷酸化位点)蛋白质表达的变化及加味四逆散对其调节作用。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 二级Spargue-Dawley雄性成年大鼠50只，体重(250±20)g，购自北京维通利华实验动物有限公司。将大鼠适应性喂养3d后随机分为正常对照组(A组)、模型组(B组)、四逆散组(C组)、生慧汤组(D组)、加味四逆散组(E组)，共5组，每组6只。

1.2 药物 实验所用的中药复方分别选用《伤寒论》的四逆散(甘草、枳实、柴胡、芍药)、《辨证录》的生慧汤(熟地黄、山茱萸、远志、生酸枣仁、柏子仁、茯神、人参、石菖蒲、白芥子)、加味四逆散由四逆散和生慧汤合方组成。上述复方由北京东直门医院制剂室以严格工艺制成免煎颗粒。

1.3 试剂与仪器 NMDAR2B、β-actin(Santa Cruz，USA)，NMDAR 2B(Tyr1472)(Abcam，USA)。蛋白定量试剂盒、ECL超敏发光液、5×上样缓冲液(北京普利来基因技术有限公司)。PMSF(Merck，Germany)，丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、SDS(Amresco，USA)。PVDF膜(Millipore，USA)。垂直电泳仪、电转槽(Bio-Rad，USA)。

1.4 方法

1.4.1 模型制作 采用D.Suchecki改良多平台法进行睡眠剥夺。在剥夺箱中放置10个平台，在平台周边注满水，把6只大鼠放置平台上，当大鼠进入异相睡眠时，由于全身肌肉张力降低，节律性地垂头触水或落入水中觉醒，从而使动物始终不能进入异相睡眠。将大鼠进行异相睡眠剥夺168h。自造模第1天始，C、D、E组每日分别灌服四逆散、生慧汤、四慧合剂，按人体用药量换算成大鼠等效剂量作为大鼠用药量，这3组的给药量分别为 2.5g/kg、13.75g/kg、16.25g/kg，灌胃容积为1mL/kg。A、B组则灌服等体积的蒸馏水。

1.4.2 取材 在SD168h点，每组随机取6只大鼠，2%戊巴比妥钠腹腔麻醉(40mg/kg)，断头，在超净台内冰上取脑，分别剥离出右侧PFC和海马CA3区，将样本分别放入1.5mL灭菌的离心管中，埋入干冰，迅速转移到-70℃的低温冰箱中。

1.4.3 Western blot流程 使用微电动匀浆器匀浆后，采用RIPA裂解液(预冷)提取细胞总蛋白。用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后，-20℃保存待测。蛋白标本以1∶4加入5上样缓冲液，在5%的十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离。每条泳道蛋白上样量为30μg。电泳结束后，用电转仪将蛋白质转移至PVDF膜上。转移后的PVDF膜用5%脱脂奶粉封闭1h，加入一抗兔抗NMDAR2B或NMDAR 2B(Tyr1472)(1∶300)，4℃过夜。用 TBS洗膜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶2000)，室温孵育1h，TBS充分洗膜。采用超敏发光液进行曝光，X线显影。将胶片的目的蛋白质条带在图像分析系统上测定其灰度值。

1.5 图像处理 采用凝胶图像处理软件检测出各条带的像素灰度值，用各指标的像素密度值除以相应的β-Actin的像素灰度值，求出各指标的相对像素灰度值。1.6统计学方法实验数据均以(¯x±s)表示，两两比较采用t检验，组间比较用单因素方差分析检验。运用SAS8.2软件进行分析。

2 结果

2.1 各组大鼠PFC和海马CA3区NMDAR2B表达的改变 与对照组比较，模型组大鼠PFC和海马CA3区NMDA受体NR2B蛋白质的表达明显减少(P＜0.05)。与模型组比较，加味四逆散组大鼠PFC和海马CA3区NMDA受体NR2B蛋白质的表达均明显增加(P＜0.05)。见表1。

表1 大鼠各脑区NMDAR2B达的改变(¯x±s，n=6)

2.2 各组大鼠PFC和海马CA3区NMDA受体NR2B(Tyr1472)表达的改变 与对照组比较，睡眠剥夺168h后，大鼠PFC脑区NMDA受体NR2B(Tyr1472)蛋白质的表达明显减少(P＜0.05)。与模型组比较，加味四逆散组大鼠PFC脑区NMDA受体NR2B(Tyr1472)蛋白质的表达均明显增加(P＜0.05)。各组大鼠海马CA3区NMDA受体NR2B(Tyr1472)蛋白质的表达无明显差异。见表2。

表2大鼠各脑区NMDAR 2B(Tyr1472)表达的改变(¯x±s，n=6)

3 讨论

研究表明，前额叶皮质和海马CA3区是参与学习与记忆的重要脑区。人体和动物实验的研究都提示前额叶脑区与工作记忆之间存在紧密的联系［1］。功能神经成像研究表明事件记忆的编码过程与左侧前额叶的激活是有关的，而记忆的提取则与右侧前额叶的激活有关，前额叶的背外侧区是参与工作记忆的最重要的脑区。海马CA3区在陈述性记忆中扮演主要的角色。譬如在记忆编码上，CA3-NR1敲除显示损伤了需要快速获得联合信息的任务学习［2］。学习与记忆神经生物学基础为突触可塑性的改变，而LTP是突触可塑性重要的功能指标。NMDAR2B在NMDA受体依赖性LTP诱导和维持处于主导地位。NMDAR2B主导的NMDA受体的膜表达和激活受到丝氨酸和酪氨酸位点磷酸化的特异性调控。与Ser1480位点磷酸化能减少NMDA受体在膜的表达量不同，其Tyr1472位点的磷酸化能稳固NMDA受体在胞膜的稳定性［3］。

根据中医五藏神理论，心藏神，肝藏魂，肾藏精。加味四逆散以补肾、养心、疏肝立法，能调节心肝肾功能异常，使肝肾二藏在心“任物”功能主宰下调控学习，记忆的编码、巩固、再现等过程。本研究证明，加味四逆散能上调睡眠剥夺导致动物PFC区NMDAR2B、NMDAR2B(Tyr1472)表达的降低;也能上调睡眠剥夺导致海马CA3区NMDAR2B表达的降低。根据既往研究结果［3］，加味四逆散能改善睡眠剥夺动物学习记忆能力，与调节PFC和CA3区NMDAR2B的蛋白质和基因表达有关。

［1］Bussey TJ，Wise SP，Murray EA.The role of ventral and orbital PFC in conditionalvisuomotor learning and strategy use in rhesus monkeys(Nacacamulatta).BehavNeurosci，2001，115(6):971-982.

［2］Nakazawa K，Quirk MC.Requirement for hippocampal C.A3 NMDA receptors in associative memory recall.science，2002，297(5579):211 –218.

［3］范新六，李峰，宋月晗，等.四慧合剂对疲劳大鼠学习记忆及海马NMDA受体亚基NR2A、NR2B和EphB2受体mRNA表达的影响.中国中西医结合杂志，2011，31(4)512-516.