阿托伐他汀对实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠体内IL-4表达的影响

杨 静，万志荣，杜继臣

（航天中心医院神经内科,北京 100049）

实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE）是多发性硬化（multiple sclerosis，MS）的理想动物模型，后者是以中枢神经系统白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫性疾病，呈慢性病程且倾向于年轻人罹患，是重要的神经系统疾病之一。但目前用于治疗MS的药物大多由于疗效局限、缺乏特异性、毒副作用大等原因限制了其临床应用。因此在EAE的基础上寻找疗效可靠、不良反应小且廉价的药物是我们目前研究的主要方向。1995年，Kobashigawa[1]等最早发现他汀类药物具有免疫调节作用。之后美国加州大学的Zamvil等[2]通过对他汀类药物的全面研究，欣喜地发现广泛用来降低胆固醇的他汀类药物也许能够治疗 MS。但目前国内应用他汀类药物治疗 EAE/MS的研究报道很少。本实验是在建立EAE模型的基础上，探讨不同剂量的阿托伐他汀对EAE神经功能的保护作用及其可能的机制，为临床应用提供重要的理论和实用价值。

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar大鼠，6～8周龄，体质量 180～200g，雌性；豚鼠，体质量（400±50）g，雌雄不限。

1.2 主要试剂

立普妥（阿托伐他汀钙片，大连辉瑞制药有限公司），碾成粉末状，用蒸馏水溶解；白细胞介素（interleukin，IL）-4放射免疫试剂盒（解放军总医院科技开发中心放射免疫所）；羊毛脂、液体石蜡油（国药集团化学试剂有限公司）；卡介苗（北京生物制品研究所）等。

1.3 免疫抗原及动物模型的制备[3]

取新鲜豚鼠脊髓，与冰生理盐水制成50%（质量/体积）的脊髓生理盐水匀浆，后与完全福氏佐剂（CFA，每毫升含6mg卡介苗）混合成油包水抗原乳剂。取上述抗原乳剂 0.5ml，分别注入 Wistar大鼠的四足掌胶质垫及背部皮下。

1.4 实验分组及药物干预

未做免疫诱导的大鼠（10只）为正常对照组。免疫诱导后的大鼠（90只）随机分为 EAE模型组，小剂量治疗组和大剂量治疗组，每组30只。每组分别于免疫诱导后第1天开始以生理盐水、2mg/kg及8mg/kg计算的阿托伐他汀灌胃。各组又根据病程分为14d、21d、28d三个亚组，每小组10只大鼠。

1.5 症状观察及神经功能评分

观察大鼠每日体质量变化、精神状态及活动情况，并进行神经功能评分，采用Hooper的7分评分标准[4]：0分：正常；1分：被毛不光整，尾部无力；2分：尾部瘫痪；3分：尾部瘫痪+后肢无力；4分：尾部瘫痪+后肢部分瘫痪；5分：后肢完全瘫痪；6分：四肢瘫痪；7分：濒死状态或死亡。

1.6 留取标本

各组均于免疫诱导后第14天（发病期）、第21天（恢复期）、第28天（复发期）处死动物，留取血清并保存。

1.7 观察阿托伐他汀对EAE病情的影响

分别记录各组发病率、发病时间、大鼠的体质量变化并进行神经功能评分。

1.8 观察阿托伐他汀对EAE病理损伤的影响

留取的脊髓组织经处理切片，行HE染色，光学显微镜下观察组织中血管周围炎性细胞浸润的情况。

1.9 IL-4的测定

取各组大鼠血清，应用IL-4放射免疫试剂盒，按实验说明，用GC-911γ放射免疫计数器测定大鼠血清中IL-4的含量。

1.10 统计学处理

所得数据经SAS软件进行统计学处理，数据用均数±标准差表示；多组计量资料均数的比较应用方差分析；各组之间率的比较用卡方检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 EAE模型的建立情况

免疫诱导后的大鼠于第 14天左右陆续出现肢体无力、瘫痪等症状，第17天左右疾病达高峰，病程持续 7～9d。EAE总发病率达 76.67%，其中经阿托伐他汀治疗后发病率明显下降至33.33%（表 1）。在观察时间较长（第 28天）的条件下大鼠发病率达100%，复发率也达到了70%，而经阿托伐他汀治疗后复发率降至 30%（表 2）。

表1 各组大鼠第14天EAE发病情况Table 1 Establishment of EAE rat models in different groups on day 14

表2 第28天组大鼠EAE复发情况Table 2 EAE rats in different groups on day 28

2.2 阿托伐他汀对EAE大鼠神经功能的影响

表3结果表明，大剂量治疗组的最高评分均值和总和评分均值都显著低于EAE模型组（P＜0.05），因此，8mg/kg阿托伐他汀治疗可使 EAE大鼠神经功能损伤明显减轻。

表3 各组大鼠神经功能评分比较Table 3 Neurological deficits score in different groups(n=30,±s)

表3 各组大鼠神经功能评分比较Table 3 Neurological deficits score in different groups(n=30,±s)

注: 小剂量治疗组: 2mg/kg阿托伐他汀; 大剂量治疗组: 8mg/kg阿托伐他汀。与EAE模型组比较,*P＜0.05

组别 最高评分均值 总和评分均值EAE模型组 3.3±0.5 42.1±25.7小剂量治疗组 2.8±0.3 39.6±14.7大剂量治疗组 1.8±0.2* 22.2±14.4*

2.3 阿托伐他汀对EAE病理损伤的影响

图 1表明，发病第 14天时光学显微镜下可见EAE大鼠中枢神经系统内有大量炎性细胞浸润形成血管袖套，三组比较，EAE模型组炎症细胞浸润数目明显高于大剂量治疗组（P＝0.01），而与小剂量治疗组之间炎症细胞浸润数目的差异没有统计学意义（P＝0.08）。

图1 各组大鼠脊髓组织病理改变Figure 1 Spinal histopathological changes of rats in different groups (HE ×100)

2.4 各组大鼠血清IL-4含量测定结果

表4结果表明，EAE大鼠血清内IL-4含量于疾病复发期（第28天）时最低，恢复期（第21天）增加到最高值。大剂量（8mg/kg）阿托伐他汀可明显增加机体内的血清IL-4含量（P＜0.05）。

表4 各组大鼠IL-4测定结果Table 4 Serum IL-4 levels in different groups (n=30,µg/L,±s)

表4 各组大鼠IL-4测定结果Table 4 Serum IL-4 levels in different groups (n=30,µg/L,±s)

注: 小剂量治疗组: 2mg/kg阿托伐他汀; 大剂量治疗组:8mg/kg阿托伐他汀。与EAE模型组比较,*P＜0.05; 与第14天比较,#P＜0.05; 与第21天比较,△P＜0.05

组别 第14天 第21天 第28天EAE 模型组 0.42±0.18△ 0.57±0.33# 0.19±0.13△小剂量治疗组 0.41±0.27△ 0.52±0.33# 0.21±0.02△大剂量治疗组 0.51±0.27△ 0.78±0.59# 0.48±0.35*△

3 讨 论

他汀类药物对于MS的疗效主要来自对其动物模型EAE的研究。Youssef等[5]及Nath等[6]先后在EAE模型的基础上观察了他汀类药物对MS的治疗作用，之后一系列人类免疫细胞的体外实验[7]和多中心的临床研究[8]都证明他汀类药物参与免疫反应的多个环节对 MS有治疗作用。临床常用的他汀类药物种类较多，本实验选用了不良反应发生率较低的阿托伐他汀进行治疗，同时它也是各种他汀类药物中参与免疫反应环节最多的一种[9]。

我们在对国内外 EAE模型进行了大量研究的基础上[10]，选用国内数量充足，价格便宜的 Wistar大鼠进行诱导，增加了免疫原的用量，并提高了完全福氏佐剂中卡介苗的含量，使得EAE总的发病率达76.67%，28天组由于观察时间较长，发病率达到100%，复发率也高达70%，成功地建立了多病程的EAE模型，为进一步的研究分析奠定了基础，也使我们的实验结果更加真实可信。

从实验结果观察EAE的整体发病情况：大鼠在免疫诱导后14天左右发病，17天时达高峰，21天左右缓解，28天时部分大鼠处于疾病的复发期。阿托伐他汀可以明显降低EAE的发病率和复发率，缩短病程，但不能显著推迟首次发病的时间。对大鼠神经功能评分进行分析，发现各组分值高低与病程一致，而将不同组中每只患病大鼠高峰期时评分进行比较，结果显示大剂量治疗组评分明显低于模型组，证实阿托伐他汀可以明显降低疾病的严重程度，减轻其临床症状。但应用小剂量阿托伐他汀治疗后不能明显改善大鼠的神经功能，考虑其对EAE的治疗必须在足够浓度下才能发挥作用，这一结果与国外报道相符[11]。

IL-4主要由Th2细胞产生，曾被命名为B细胞生长因子-1，不仅能促进B细胞的分化与增殖；还能够诱导T淋巴细胞增殖，促使Th0淋巴细胞向Th2淋巴细胞转化，并促使Th2类细胞因子的产生[12,13]。在EAE的研究中 Khoury等[14]发现IL-4能抑制Th1细胞的活化及炎性细胞因子的产生，进而促使EAE的恢复，故是EAE的负向调节因子。本实验结果为三个时间点比较显示，第 21天组大鼠血清中 IL-4含量明显高于第14天和第28天组（P＜0.05），而第14天与第28天组大鼠血清中IL-4含量之间的差异无统计学意义（P＞0.05）。三组比较，EAE模型组 IL-4含量明显低于大剂量治疗组（P＜0.05），而与小剂量治疗组比较IL-4含量的差异无统计学差异（P＞0.05）。本实验中EAE模型组血清IL-4含量的分析显示，当动物处于发病初期时血清中IL-4含量与空白对照组相比显示出明显的降低，说明IL-4在疾病早期就发挥了一定作用。而当第 21天时，动物多处于疾病的缓解期，神经功能缺损程度也明显好转时，IL-4水平也出现明显升高且与空白对照组已无差异。当第28天时，模型组10只动物中有7只出现了临床症状的二次发作，并且在处死时大部分仍然处于疾病的活动期，IL-4水平出现下降，且明显低于空白对照组的水平。上述实验结果说明，动物血清中细胞因子IL-4参与了疾病损伤的修复过程，而且IL-4的水平变化和疾病的活动性呈负相关。在两个治疗组中也分别对第 14天、第 21天、第 28天三个时间点进行比较，小剂量治疗组IL-4水平在三个时间点分别和EAE模型组相比均有数值上的升高，但没有达到统计学差异。大剂量阿托伐他汀治疗后，可以显著提高疾病各个时期IL-4的表达，在整个疾病过程中起到保护机体，促进神经损伤恢复的作用，也体现了药物作用的持续性[15]。

综合本实验结果可以发现，阿托伐他汀可以明显降低EAE的发病率和复发率，缩短病程，减少疾病对机体的神经功能损害，促进病情缓解。而这些作用与其提高机体中IL-4的含量紧密相关。同时发现阿托伐他汀对EAE的治疗作用是剂量相关性的，只有足够大的药物浓度才能达到其治疗目的，但仅通过本实验还不能确定其安全有效的用药剂量。因此要实现将他汀类药物应用于 MS的治疗，仍需进行大量的动物实验及临床实践。

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