干扰素治疗前后慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞Toll样受体4的变化

阎双缓，曹志宸

（1.河北省石家庄市第五医院感染五科，河北，石家庄050021；2.河北医科大学第三医院中西医结合肝病科，河北，石家庄050051）

干扰素治疗前后慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞Toll样受体4的变化

阎双缓1，曹志宸2

（1.河北省石家庄市第五医院感染五科，河北，石家庄050021；2.河北医科大学第三医院中西医结合肝病科，河北，石家庄050051）

目的探讨慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）患者干扰素治疗前后外周血单核细胞To11样受体4（To11-1ike receptor4，TLR4）的变化及其意义。方法用流式细胞仪检测30例健康人、65例CHB患者外周血单核细胞表面TLR4的表达，酶联免疫吸附测定法检测上述患者血清白细胞介素-6（inter1eukin-6，IL-6）的水平。结果CHB患者组与健康对照组比较，外周血单核细胞TLR4表达水平及血清IL-6水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。患者应用干扰素治疗12周时TLR4水平及IL-6水平均下降，但与治疗前比较差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗24周时，患者TLR4水平及IL-6水平均明显下降，与治疗前比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论TLR4可能与CHB发病有关，干扰素抗病毒治疗可降低外周血单核细胞TLR4水平。

肝炎，乙型，慢性；单核细胞；白细胞介素6

To11样受体（To11-1ike receptors，TLRs）是连接天然免疫及获得性免疫系统的重要桥梁［1-2］，To11样受体4（To11-1ike receptor 4，TLR4）主要表达在巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞及内皮细胞上，它识别病原体相关分子模式（pathogen-associated mo1ecu1ar patterns，PAMPs）而引起机体特异性免疫反应。本研究以慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，

CHB）患者为对象，观察其干扰素治疗前后外周血单核细胞表面TLR4受体表达水平，探讨TLR4在CHB中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料：收集2010年2月—2011年2月石家庄市第五医院住院CHB患者65例，男性42例，女性23例，年龄35～76岁，平均（51.5±15.2）岁。诊断符合2000年西安会议修订的《病毒性肝炎防治方案》的诊断标准［3］。e抗原阳性患者丙氨酸转氨酶≥2倍正常值上限，乙型肝炎DNA＞104U/mL，e抗原阴性患者丙氨酸转氨酶≥2倍正常值上限，乙型肝炎DNA＞103U/mL，排除其他甲型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎或人免疫缺陷病毒的合并感染及肝硬化、肝癌等失代偿肝病患者，近3个月未用过抗病毒药物及糖皮质激素等影响免疫功能的药物。健康对照组30例，男性18例，女性12例，年龄22～66岁，平均（31.5±11.3）岁。

1.2 治疗方案：所有CHB患者给予干扰素α-2b 针500万U隔日1次（北京凯因益生，批号S20030032），治疗12、24周时检测外周血单核细胞TLR4水平及血清IL-6水平。

1.3 检测方法

1.3.1 流式细胞仪检测外周血单核细胞TLR4：清晨抽取静脉血2mL，用0.2%乙二胺四乙酸抗凝，4h内检测。取乙二胺四乙酸抗凝血细胞悬液100μL，分别加入APC-anti-CD14单抗10μL和PE-anti-TLR4单抗10μL，室温放置30min，加入红细胞裂解液2mL，避光静置15min，离心，1 000μL磷酸盐缓冲液振荡洗涤2次，不加抗体设置阴性对照。离心弃去保存液，所得细胞以磷酸盐缓冲液调整浓度至2×109/L，将标本置于流式细胞仪上，以APC-anti-CD14阳性设门，共获取门内10 000个单核细胞。经Ce11quest统计软件分析，获取直方图，以平均免疫荧光强度（mean f1uo-rescence intensity，MFI）表示TLR4的表达强度。

1.3.2 血清白细胞介素-6（inter1eukin-6，IL-6）水平检测：清晨采集静脉血5mL，常规离心后取上清液，-80℃冰箱保存，待测。酶联免疫吸附测定试剂盒为晶美生物有限公司分装的美国Genzyme公司产品。

1.3.3 血HBV-DNA检测：采用PCR结合荧光探针的体外DNA扩增和检测技术定量检测DNA含量。

1.4 统计学方法：应用SAS6.12统计软件进行数据处理，计量资料以±s表示，组间两两比较采用q检验及线性相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 外周血单核细胞TLR4水平及血清IL-6水平的表达：CHB患者组治疗前与正常对照组比较，外周血单核细胞TLR4表达水平及血清IL-6水平均升高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。与治疗前比较，患者应用干扰素针治疗12周时TLR4水平及IL-6水平均下降，但差异无统计学意义（P＞0.05）；治疗24周时，患者TLR4水平及IL-6水平均明显下降，与治疗前比较差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。CHB患者经干扰素针治疗后HBV-DNA呈下降趋势（P＜0.05），见表1，2。

2.2 外周血单核细胞TLR4的表达与血清IL-6水平的关系：CHB患者组外周血单核细胞TLR4表达水平与血清IL-6表达水平呈现显著的正相关（r=0.768，P＜0.05）。

表1 CHB患者外周血单核细胞TLR4与血清IL-6水平（±s）

表1 CHB患者外周血单核细胞TLR4与血清IL-6水平（±s）

*P＜0.05 #P＜0.01与对照组比较；△P＜0.05 ☆P＜0.01与治疗前比较（q检验）

组别例数TLR4 （MFI）IL-6 （ρ/ng·L-1）健康对照组303.2±2.115.6±5.6 CHB患者组治疗前657.5±3.6*94.5±52.2#CHB患者组治疗12周656.4±8.479.5±36.6 CHB患者组治疗24周654.5±3.6△38.4±12.8☆

表2 CHB患者干扰素治疗前后HBV-DNA对数值变化（n=65，±s）

表2 CHB患者干扰素治疗前后HBV-DNA对数值变化（n=65，±s）

*P＜0.05与治疗前比较（q检验）

检测时间HBV-DNA（1og U/mL）CHB患者组治疗前6.98±1.52 CHB患者组治疗12周5.56±1.25 CHB患者组治疗24周3.17±2.51*

3 讨 论

免疫介导的肝损伤是多种慢性肝病的主要发病机制，TLRs信号系统在肝细胞损伤中起重要作用。其中TLR4的识别谱较广，生物学作用广泛，它表达于细胞表面，能直接识别病毒蛋白颗粒，不但具有促进细胞因子的合成与释放，促进免疫细胞成熟、分化和功能化等作用，还在调节机体对入侵病原体的免疫应答水平及抗病毒方面有不容忽视的作用［4］。Mozer-Lisewska等［5］在HBV感染儿童患者的肝组织中发现TLR4的表达，而正常肝组织则无表达。提示TLR4在乙型肝炎发病中的作用是一个值得探讨的问题。

本研究结果显示，CHB患者外周血单核细胞TLR4水平高于健康人，且外周血单核细胞TLR4表达水平与血清IL-6表达水平呈正相关。与尉秀清等［6］的研究结果一致。目前关于TLR4表达的调控机制研究还比较少。内毒素是TLR4最重要的配体，体内内毒素等刺激信号以及IL-6高水平的表达可导致外周血单核细胞TLR4高水平的表达［6-7］。在CHB患者体内存在内毒素、凋亡细胞等TLR4刺激信号［8-9］，有可能导致外周血单核细胞对上述刺激信号产生过度反应，以及单核细胞IL-6高水平表达。IL-6可以通过多种信号通路导致肝细胞的凋亡和坏死，慢性乙型肝炎血清IL-6的水平与病情进展有关，与肝脏炎症程度相关［10-11］。总之，CHB患者外周血单核细胞TLR4表达水平与血清IL-6表达水平可以互相影响，从而在慢性乙型肝炎发病中发挥一定作用。

本研究中所有患者均肌内注射干扰素抑制HBV。结果表明，干扰素治疗后随着患者HBVDNA载量下降，外周血单核细胞TLR4水平及血清IL-6水平均为下降趋势，治疗24周时已降至正常水平。干扰素兼具抗病毒和免疫调节的双重功效，随着抗病毒疗程延长，HBV-DNA载量下降，肝脏炎症减轻，可能使内毒素血症随之减轻。内毒素等刺激信号减弱，IL-6水平下降，TLR4水平逐渐降低。

综上所述，外周血单核细胞TLR4表达水平与CHB的发病及治疗转归有关。本研究观察时间尚短，仅为24周，大部分患者仍在坚持治疗，我们将继续观察。

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（本文编辑：刘斯静）

R735.7

B

1007-3205（2012）10-1173-03

2012-02-13；

2012-04-06

石家庄市科技局科技支撑项目（09146763）

阎双缓（1969-），女，河北石家庄人，河北省石家庄市第五医院副主任医师，医学硕士，从事病毒性肝炎基础及临床研究。

10.3969/j.issn.1007-3205.2012.10.023