H22肝癌小鼠择时服用人参皂甙抗氧化及免疫功能的实验研究

王 秀，何裕民

(1.皖南医学院 中西医结合研究中心，安徽 芜湖 241002;2.上海中医药大学 中医基础理论教研室，上海 201203)

人参性温大补，是扶正补益的代表药物，现代研究证实多种人参皂甙具有抗肿瘤作用［1，2］。现代时间生物学研究表明，人体的生理功能、病理变化具有昼夜节律变化，同样的药物在不同时间应用后，疗效也不相同。本课题以肝癌为模型，选取卯、酉二个时间点为用药时间，从抗氧化、免疫等方面对人参皂甙择时治疗肝癌进行探讨。

1 实验材料与方法

1.1 动物与瘤株 昆明种小鼠90只，雄性，(14±2)g，由上海斯莱克实验动物中心(合格证号:SCXK(沪)2003-0003)提供。小鼠H22肝癌腹水型细胞，购自上海麦莎生物科技有限公司，细胞复苏后注入小鼠腹中，腹水传代保存。

1.2 方法 将小鼠置于人工光照周期 LD12∶12(7∶00～19∶00时光照，19∶00～7∶00 时黑暗)，恒温恒湿，清洁级条件下常规饲养。2周后，采用H22肝癌细胞悬浮液进行右前肢皮下接种造模，造模后继续在人工光照环境下喂养。待瘤体长至0.5 cm左右，随机分组，一组为正常组，一组为模型组，余组为择时用药组，每组10只小鼠。用药组予以人参皂甙溶液灌胃［25 mg/(kg·d)］，正常组、模型组予以生理盐水灌胃。用药10 d后取血，离心取上清，－20℃保存待测。小鼠处死后，解剖取脾脏、胸腺称重，并剥取肿瘤，称重后，取肿瘤组织－80℃保存备用。

1.3 造模方法 抽取腹腔传代小鼠腹水，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，收集细胞，用 PBS液清洗两次后，取中上层细胞，以生理盐水调整细胞密度为3×107/ml，于昆明种小鼠右侧前肢腋下行无菌皮下接种，接种量为每只0.2 ml细胞悬液，每只小鼠接种的细胞总数为6×106个。

1.4 用药时间的择定 给药时间根据中医人体昼夜阴阳消长节律，并结合现代人体生理昼夜节律研究结果，分别于 5∶00～7∶00(下以卯时代称)，17∶00～19∶00(下以酉时代称)两个时间段给药。

1.5 药物、试剂与仪器 人参皂苷，总皂甙含量≥80%，上海康九化工有限公司产品(批号:Z060126)。白细胞介素2(IL-2)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒(武汉博士德生物有限公司)，超氧化物歧化酶(SOD)(批号:20060923)，总抗氧化能力(批号:20060920)，谷胱甘肽(GSH)(批号:20060921)，蛋白定量测试盒(购自南京建成生物工程研究所)。酶标仪(美国Bio-Tek公司ELX-800型)，721可见光分光光度计(上海分析仪器总厂)，显微镜(日本Olympus倒置光学显微镜)，电子天平(上海天平仪器厂JA1003)。

1.6 观测指标及测量方法 胸腺指数与脾脏指数的测定:小鼠死后，解剖取出胸腺、脾脏，称重并计算胸腺指数、脾脏指数。方法如下:胸腺指数=胸腺重量(mg)/体重(g) ×1 000‰，脾脏指数=脾脏重量(mg)/体重(g) ×1 000‰。白细胞计数，采尾血(10μl)，光学显微镜下用计数板进行白细胞计数。白细胞介素 2(IL-2)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，血管内皮生长因子(VEGF)按试剂盒说明操作。取出冰冻肿瘤组织，准确称取肿瘤组织的重量，按重量体积比1∶9加预冷生理盐水，在冰上匀浆器匀浆，1 500 r/min，离心5 min，离心取组织匀浆上清液测超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力、谷胱甘肽(GSH)，严格按试剂盒说明书操作。

2 结果

2.1 人参皂甙择时治疗肝癌小鼠的抗氧化能力的差异观察 人参皂甙可降低肿瘤组织的谷胱甘肽活性，与用药时间不同有相关趋势，统计无显著性差异(P＞0.05)。卯时用药肿瘤组织中的总抗氧化能力显著降低，SOD浓度显著升高，有显著性差异(P＜0.05)。

表1 人参皂甙择时治疗肝癌小鼠的谷胱甘肽、总抗氧化能力与SOD

2.2 人参皂甙择时治疗对肝癌小鼠细胞因子的差异观察 与模型组相比，人参皂甙可降低肝癌小鼠的血清 IL-2、TNF-α、VEGF的含量，有显著性差异(P＜0.05)，但卯时组与酉时组之间无显著性差异(P ＞0.05)。

表2 人参皂甙择时治疗肝癌小鼠的IL-2、TNF-α与VEGF

2.3 人参皂甙择时治疗对肝癌小鼠的外周血白细胞、脾脏指数、胸腺指数的的差异观察 人参皂甙可使外周血细胞数升高，脾脏重量增加，有显著性差异(P ＜0.05)，与用药时间无相关性(P ＞0.05)，对胸腺重量无明显增重作用(P＞0.05)。

表3 人参皂甙择时治疗肝癌小鼠的外周血白细胞及脾脏、胸腺指数的变化

3 讨论

李时珍·《本草纲目》中提出春夏秋冬季节不同，所用药物的寒热温凉四气与升降浮沉应有相应的选择，一日之时如四季，一日内不同时段所用药物寒热温凉四气与升降浮沉应有相应的选择。时间药理学研究亦证实，很多药物的作用与人体生物节律有着极其密切的关系，同一种药物同等剂量因给药时间不同，作用也不一样。在本实验中观察到不同时间服用人参皂甙的抗瘤作用不同，卯时用药的抑瘤作用明显优于酉时用药，本课题从抗氧化及免疫功能方面探讨其作用机制。

人参皂甙具有抗自由基的作用，能降低疲劳小鼠肝组织中恢复期的MDA含量，减少自由基对细胞膜的氧化损伤作用，并且能提高小鼠肝组织中SOD和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性［3］，还可以有效地清除长寿命自由基，减轻辐射损伤［4］。本课题实验结果显示人参皂甙可明显降低小鼠肿瘤组织的总抗氧化能力和谷胱甘肽含量，增高SOD含量，且与用药时间不同有相关趋势，酉时用药作用弱于卯时用药。有研究表现诱发凋亡的因素都是促氧化剂，抑制凋亡的都是自由基清除剂或抗氧化剂，活性氧可使癌逆转或凋亡［5］。

肿瘤坏死细胞可引起炎症，炎症又为肿瘤的生长提供良好的环境，刺激细胞DNA损伤，增加基因不稳定性，重塑细胞外基质和促进肿瘤血管和淋巴管生成。炎症通过直接或间接的作用参与了肿瘤血管新生和肿瘤细胞生长、侵袭和转移［6］。炎症有助于肿瘤细胞的增殖和存活，促进肿瘤血管生成和转移，破坏适应性免疫反应［7］。IL-2作为炎症因子，参与了炎症过程，随着IL-2含量和作用的增大，可加重炎症反应。TNFα又可刺激机体产生一系列炎症细胞因子(主要为IL家族)的瀑布效应［8］。可见炎性细胞因子在肝癌生长过程中的作用非常重要［9］。且动物实验研究表明，慢性或急性炎症时内毒素引起的蛋白分解代谢增强可以成为肿瘤恶液质的原因［10］。人参为扶正固本、大补元气之品，有增强免疫、强身健体的作用，对正常动物和免疫功能低下的动物，均有提高免疫功能的作用，能增强非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫。本课题实验结果显示人参皂甙可降低血清内IL-2、TNFα的水平，抑制体液免疫功能，另一方面，又增强了机体的细胞免疫功能，且在体内可明显降低血清VEGF的含量，与用药时间无明显相关性。提示人参皂甙可能是通过减轻机体的炎症反应，增强抗应激能力以达到抑制肿瘤生长的作用。

有研究表明，肝癌大鼠的免疫系统节律已发生紊乱，机体免疫调节失常［11］。人参皂甙不同时间服用对IL-2、TNFα、VEGF等细胞因子血清含量无明显影响，但不同时间服用对其紊乱节律调整作用是否一致，还需进一步研究。

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