莫诺苷对二磷酸腺苷诱导兔血小板聚集后血栓素B2的影响

左玮，王晓锋，艾厚喜，张丽，季晖，陈乃宏，王

莫诺苷对二磷酸腺苷诱导兔血小板聚集后血栓素B2的影响

左玮1,2，王晓锋2,3，艾厚喜2，张丽2，季晖1，陈乃宏3，王文2

目的观察莫诺苷对二磷酸腺苷(ADP)诱导兔血小板聚集后血栓素(TX)B2含量的影响。方法利用酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)试剂盒，检测不同条件下ADP诱导血小板聚集后TXB2的含量。结果与对照组相比，莫诺苷能显著抑制由ADP诱导兔血小板聚集后TXB2的升高(P＜0.001)。结论 莫诺苷可以不同程度抑制ADP诱导兔血小板聚集后TXB2的生成。

莫诺苷；血小板聚集；血栓素B2；兔

[本文著录格式]左玮，王晓锋，艾厚喜，等.莫诺苷对二磷酸腺苷诱导兔血小板聚集后血栓素B2的影响[J].中国康复理论与实践,2012,18(4):329-330.

山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)是山茱萸科植物，性微温，味酸、涩，归肝、肾经，具有补益肝肾、涩精固脱的作用。环烯醚萜苷是本室研究得到的山茱萸有效成分。对山茱萸环烯醚萜苷进一步分离，得到莫诺苷。前期研究发现，莫诺苷对SH-SY 5Y神经细胞具有抗氧化、抗凋亡等保护作用[1-4]；莫诺苷能减小大鼠局灶性脑缺血再灌注模型脑梗死体积[5]，抑制皮层脂质过氧化[6]。此外，莫诺苷能显著抑制二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、花生四烯酸(arachidonic acid,AA)和血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)诱导的兔血小板聚集的作用，尤其对ADP的抑制作用选择性强[7]。血栓素(thromboxane, TX)A2是目前已发现的最强的缩血管物质与血小板聚集剂之一[8]。其稳定的代谢产物为TXB2。本文通过体外研究莫诺苷在ADP诱导血小板聚集后对TXB2含量的影响，进一步从分子角度探讨莫诺苷抗血小板聚集的可能机制。

1 材料与方法

1.1药物 莫诺苷由本室从山茱萸中提取制备，用高效液相分析，纯度约98.5%；阿斯匹林(acetyl salicilic acid,ASA)为SIGMA公司产品，用时用蒸馏水溶解，以0.1mol/L NaHCO3调pH至7.0左右，再加蒸馏水稀释到所需浓度。

1.2试剂 ADP：SIGMA公司，配制成7.5mg/m l储存液，分装，-20℃密封保存，临用前稀释，终浓度为10μmol/L；TXB2ELISA试剂盒(R&D)。

1.3动物及仪器 新西兰大耳白兔：体重(3.0±0.5) kg，SPF级，由北京开源兔业养殖场养殖，合格证号SCXK(京)2006-0005；SC-2000 M icrofuge低温离心机：美国BECK-MAN公司；IMT22型全自动酶标仪(LP400型)：法国Diagnostic Pasteur公司。

1.4方法

1.4.1血小板的制备[9]2～3 kg雄性新西兰大耳白兔，经兔颈总动脉取血，枸橼酸钠抗凝(1∶9)，230 g离心10 m in，取上清得富含血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)；PRP 800 g离心15m in，得血小板。

1.4.2负载血小板悬液的制备 配制无钙Hepes buffer (Hepes 3.5 mmol,NaCl 137 mmol,KCl 2.7 mmol, NaH2PO43mmol,M gCl21mmol,pH7.4)和1mmol/L含钙Hepes buffer(Hepes 3.5 mmol,NaCl 137 mmol,KCl 2.7 mmol,NaH2PO43 mmol,M gCl21 mmol,CaCl21 mmol,glucose 5mmol)。血小板经无钙Hepes buffer洗涤2次；再用1mmol/L含钙Hepesbuffer重悬。

1.4.3加药作用及离得样品 上述制得的血小板样品分别加入各药品溶液，莫诺苷低、中、高剂量组分别为3.0mg/m l、6.0mg/m l、12.0mg/m l；对照组加生理盐水；阳性药选择ASA(ASA组)，0.5mg/m l。体外作用5 m in；加ADP(10μmol/L)聚集5 m in；然后加入EDTA(2mmol/L)和消炎痛(Indomethacin,50μmol/L)终止炎症反应；最后14000 r/m in离心2m in，取得上清用于测定TXB2的含量。

按TXB2ELISA试剂盒(R&D)操作[10]，每组5份。

1.5统计学分析 实验数据采用SPSS 13.0统计学软件进行统计处理。组间样本均数比较用单因素方差分析，显著性水平α=0.05。

2 结果

与对照组相比，ASA组显著抑制血小板聚集TXB2的产生，抑制率达到70%左右。表明血小板聚集功能正常，而ASA可以很强地抑制血小板聚集引起的TXB2含量的升高。与对照组相比，莫诺苷的低、中、高组可剂量依赖性降低ADP诱导血小板聚集引起TXB2含量的升高，低剂量组(3mg/m l)就开始起效(抑制率达30%左右)。见表1。

表1 莫诺苷对ADP诱导的血小板聚集TXB2含量的影响

3 讨论

心脑血管疾病发病率不断升高，给社会和国家带来巨大的负担，抗血小板聚集药物在防治心脑血管疾病过程中起着重要作用。常用抗血小板聚集药物阿司匹林在预防脑卒中和急性心肌梗死方面发挥着不可替代的作用，但长期服用容易造成胃溃疡、肾炎以及精神障碍等疾病。因此，筛选一种选择性高、作用强、可逆转、副作用小的口服抗血小板聚集药物，是未来的必然趋势。中药治疗心脑血管疾病历史悠久。20世纪50年代以后，采用活血化瘀法治疗心脑血管疾病等取得了引人注目的进展。活血化瘀中药方剂防治血管性疾病的作用机制主要为防治血栓形成和改善血液循环。研究活血化瘀中药的活性成分，进而开发出新药，是中药现代化研究的课题。一些单体化合物及有效成分在抗血小板聚集方面的作用也得到研究证实，如银杏内酯、姜黄酮、丹酚酸及人参皂苷等均有很好的作用。血小板聚集功能在生理性止血以及病理性血栓形成中起着重要的作用。

目前已知血小板的聚集反应至少通过ADP、TXA2和PAF等3条途径激活，而各种诱导剂如ADP、AA、PAF等均可通过上述不同途经激活血小板聚集。在前期的研究中，我们初步观察了莫诺苷可以不同程度抑制ADP、AA、PAF诱导的兔血小板聚集，尤其是对ADP诱导的兔血小板聚集有较好的选择性。血小板与血管壁接触时合成和释放TXA2并促进血小板聚集。由于TXA2的半衰期很短，目前难以直接测定，故国内外一般将TXA2稳定的代谢产物TXB2作为判断其浓度的指标。本文着重通过测定莫诺苷是否能够抑制ADP诱导后TXB2的生成，探讨莫诺苷抑制血小板聚集的可能机制。从实验数据来看，莫诺苷可以不同程度抑制ADP诱导兔血小板聚集后TXB2的生成。从分子机制证明，莫诺可能通过减少TXB2的含量，抑制兔血小板聚集。但是体内抗凝机制十分复杂，涉及多种因素，因此对于莫诺苷抗凝机制还有待于进一步研究。

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Effects of M orroniside on Inhibiting Throm boxane B2after Platelet Aggregation Induced by Adenosine Diphosphate in Rabbits

ZUOWei,WANG Xiao-feng,AIHou-xi,etal.China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,Jiangsu,China

Ob jectiveTo study the effects ofmorroniside on thromboxane B2in the condition of platelet aggregation in rabbits induced by adenosine diphosphate(ADP).M ethodsThe level of TXB2was determ ined by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).Resu ltsCom pared w ith the controls,morroniside significantly inhibited the increase of TXB2induced by ADP(P＜0.001).ConclusionM orroniside can inhibit the levelof TXB2by inhibiting the plateletaggregation in rabbits induced by ADP.

morroniside;plateletaggregation;thromboxane B2;rabbits

R285.5

A

1006-9771(2012)04-0329-02

2011-08-05)

1.“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX 09103-366)；2.国家自然科学基金项目(30973893)；3.北京市自然科学基金项目(7102077)；4.北京市教委(PXM 2011_014226_07_000071)；5.2011年北京市卫生系统高层次卫生技术人才。

1.中国药科大学，江苏南京市210009；2.首都医科大学宣武医院，北京市100053；3.中国医学科学院药物所，北京市100050。作者简介：左玮(1986-)，女，河北保定市人，硕士研究生，主要研究方向：神经药理、中药药理。通讯作者：季晖。

10.3969/j.issn.1006-9771.2012.04.004