光谱法研究Zn(Ⅱ)存在下环丙沙星与DNA的相互作用

2012-05-05付彩霞刘明鹭张怀斌高宗华

化学与生物工程 2012年1期

付彩霞，刘明鹭，张怀斌，高宗华

(滨州医学院化学教研室，山东烟台 264003)

DNA是重要的生物大分子，是体内抗癌药物的主要作用标靶。药物与DNA作用能不同程度地影响DNA的复制和合成，从而抑制癌细胞的恶性生长。因此，通过研究药物与DNA的作用，可获得更方便的检测方法，使药物的初步筛选更加有效。DNA和金属配合物及药物分子的相互作用研究是近年来活跃的前沿研究领域之一[1]。

由于喹诺酮药物可能产生长期的遗传毒性，喹诺酮药物与真核生物DNA间相互作用的研究已受到广泛的重视[2]。环丙沙星(CPFX)为合成的第三代喹诺酮类抗菌药物，具广谱抗菌活性，杀菌效果好。Zn2+是存在于人体中的重要生物离子。虽然环丙沙星与金属的配位行为和生物活性已有研究[3，4]，但对Zn(Ⅱ)存在下环丙沙星与DNA的结合研究相对较少。作者在此用紫外光谱法和荧光光谱法研究了模拟生理条件下、Zn(Ⅱ)存在下环丙沙星与鲱鱼精DNA的相互作用，拟为研究环丙沙星的作用机理及可能产生的毒副作用提供参考依据。

1 实验

1.1 试剂与仪器

鲱鱼精DNA、三羟甲基氨基甲烷(Tris，分析纯)，北京拜尔迪生物技术有限公司；环丙沙星，中国药品生物制品检定所。

用0.05 mol·L-1pH值7.4的Tris-HCl缓冲溶液(内含0.1 mol·L-1NaCl维持离子强度)配制浓度为1.0×10-5mol·L-1鲱鱼精DNA储备溶液；环丙沙星配制成1.0×10-6mol·L-1的储备溶液；其它试剂均为分析纯；实验用水为二次蒸馏水，无荧光杂质。

pH-3C型酸度计，上海逸龙科技有限公司；电热恒温水浴锅，上海实验仪器厂有限公司；KQ-500B型超声波清洗器，昆山超声仪器有限公司；AR1140型电子分析天平，美国奥豪斯电子天平公司；LS-55型荧光分光光度计，美国PE公司；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 方法

1.2.1 紫外吸收光谱的测定

固定CPFX的浓度为1.0×10-6mol·L-1，用微量注射器加入1.0×10-5mol·L-1DNA与1.0×10-4mol·L-1Zn2+溶液各50 μL，记录待测溶液在200～400 nm的紫外吸收光谱。以空白试剂为参比。

1.2.2 荧光发射光谱的测定

在1 cm比色皿中加入3.00 mL CPFX溶液，用微量注射器逐次加入1.0×10-5mol·L-1的DNA溶液进行滴定，摇匀，静置5 min，在21 ℃下扫描荧光发射光谱，激发波长为280 nm。

将DNA在沸水浴中加热15 min后迅速放入冰水浴中冷却15 min，同上扫描荧光发射光谱。

固定CPFX和Zn2+的浓度，改变DNA的浓度，同上扫描荧光发射光谱。

2 结果与讨论

2.1 Zn2+和DNA存在下环丙沙星的紫外吸收光谱

加入Zn2+后，CPFX和CPFX-DNA的紫外吸收光谱如图1所示。

1～4：CPFX，CPFX+DNA，CPFX+Zn2+，CPFX+DNA+Zn2+ cCPFX=1.0×10-6mol·L-1,cDNA=1.6×10-7mol·L-1,cZn2+=1.6×10-6mol·L-1

由图1可知，CPFX在270 nm和320 nm处有最大吸收，Zn2+的加入对CPFX与鲱鱼精DNA的结合反应有很大的影响，最大吸光度增大，最大吸收波长红移(特别是320 nm处)。说明DNA与CPFX-Zn2+之间的结合不符合静电式结合，应为嵌入式或沟槽式结合[5]。

2.2 Zn2+和DNA存在下环丙沙星的荧光发射光谱(图2)

1～4：CPFX，CPFX+DNA，CPFX+Zn2+，CPFX+DNA+Zn2+ cCPFX=1.0×10-6mol·L-1,cDNA=1.6×10-7mol·L-1,cZn2+=1.6×10-6mol·L-1

由图2可知，CPFX的荧光峰在447 nm处，分别加入Zn2+和相同浓度的DNA后，CPFX的荧光峰位置不变，但是荧光强度明显降低。说明CPFX与DNA、Zn2+均发生了相互作用；当Zn2+和DNA同时存在时，CPFX荧光强度降低的程度更大，表明Zn2+和DNA 对CPFX荧光具有协同猝灭作用，可以推断CPFX、Zn2+和DNA之间形成了三元络合物。

2.3 DNA对CPFX的荧光猝灭机理

荧光猝灭可由Stern-Volmer方程[6，7]表示：

F0/F=1+KSVcDNA

式中:F和F0为有无DNA时的荧光强度；cDNA为DNA浓度；KSV为猝灭常数。

DNA对CPFX荧光强度的影响见表1。

表1 DNA对CPFX荧光强度的影响

由表1可知，随着CPFX中DNA的加入，F0/F的数值不断增大，即CPFX的最大荧光发射峰强度逐渐降低，表明DNA的加入对CPFX有荧光猝灭作用。

以F0/F为纵坐标、cDNA为横坐标作图，结果如图3所示。

图3 F0/F与cDNA的关系图

由图3可知，曲线线性关系良好，相关系数为0.9929，由曲线斜率计算得KSV=2.07×105L· mol-1。

荧光猝灭的机理很多，常见的有由于猝灭剂与荧光物质之间的碰撞引起的动态猝灭及形成基态复合物而引起的静态猝灭等。如果按动态猝灭处理，则猝灭方程可由下式表示：F0/F=1+Kqτcq，式中:Kq为双分子猝灭过程速率常数，τ为猝灭剂不存在时荧光分子的平均寿命，约为10-8s，cq为猝灭剂的浓度。计算得到DNA对CPFX的速率常数Kq为2.07×1013L· mol-1·s-1，远大于小分子与生物大分子之间最大的扩散控制的碰撞常数2×1010L· mol-1·s-1。由此判断DNA对CPFX的猝灭作用不是动态猝灭，而是形成基态复合物的静态猝灭。

2.4 CPFX-DNA、CPFX-Zn2+二元络合物的组成及结合常数

根据静态猝灭理论和lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlgcq(KA为CPFX与猝灭剂之间的结合常数，n为结合位点数),分别作出CPFX-DNA、CPFX-Zn2+体系的双倒数关系图，并通过斜率和截距求出CPFX与猝灭剂之间的结合常数和结合位点数，见表2。

表2 CPFX与DNA或Zn(Ⅱ)的结合常数和结合位点数KA

由表2可知，CPFX-DNA、CPFX-Zn2+的结合常数和结合位点数均较小，说明CPFX与DNA、CPFX与Zn2+相互作用都很微弱，但Zn2+存在时可能会对CPFX与DNA体系产生不可忽略的影响。

2.5 热变性DNA 对环丙沙星荧光强度的影响

将DNA在沸水浴中加热15 min后迅速放入冰水浴中冷却15 min，变性得到的单链(ssDNA)对CPFX的荧光猝灭程度通常有所减小。这是因为热变性能破坏DNA结构中碱基对的有序排列，并导致DNA解旋[8]，但由于ssDNA是以线团状形式存在于溶液中，在线团的表面形成了可以与小分子发生氢键作用的许多凹点，变性得到的ssDNA与dsDNA仍在一定浓度范围内对CPFX-Zn2+的荧光强度有线性猝灭的作用。本实验中变性DNA与CPFX反应，变性DNA和天然DNA对CPFX的作用能力几乎一致。这进一步表明DNA与CPFX-Zn2+配合物是通过沟槽作用相互结合[9]。