液基细胞学在对NSCLC胸腔积液癌细胞ERCC1等基因检测中的应用

陶 玉 吉志固 刘玉山 陆晓云 周建云 陈亚丽 何 松

在肺癌的临床诊治工作中，我们常常遇到许多患者就诊时的首发症状为胸腔积液或心包积液，这时的临床分期已属ⅢB或Ⅳ期，即肺癌晚期。对其胸腔积液或心包积液查找恶性肿瘤细胞并分型诊断，可能成为这部分患者获得病理学依据的唯一方法。目前对非小细胞肺癌(non-small cell lung cance，NSCLC)的标准化疗，主张以ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ等基因检测结果为指导的个体化治疗。我们采用液基细胞学检测技术(liquid based cytology test，LCT)，对71例胸腔积液或心包积液标本在作出细胞学诊断的同时进行了ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ等基因检测，旨在为晚期NSCLC的个体化治疗提供实验依据。现将我们的实验结果总结如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源

收集我院2009年2月～2011年12月的胸腔积液或心包积液标本，共获得晚期NSCLC 71例，所有标本必须满足以下条件:①液基细胞薄片经HE染色后由2位资深细胞学医师共同阅片并一致诊断为NSCLC;②HE染色的液基细胞片内可见较多癌细胞;③有足够的剩余标本可供免疫细胞化学检查。71例晚期NSCLC中腺癌69例，鳞癌1例，腺鳞癌1例。男性患者40例，女性31例;年龄39～86岁，平均年龄62.3岁。

1.2 设备及试剂

1.2.1 液基细胞薄片制作仪器与试剂 程控离心机 Hettich 46，超柏 Auto Cyte PREP液基细胞薄片自动制片机(美国Tripath ImaginInc)及随机配置的一次性耗材:12 m l离心管、移液Tip头、细胞沉降管、玻片、红色固定液。自配耗材:50 ml离心管、Tris缓冲粉、苏木精、伊红、无水乙醇。

1.2.2 免疫细胞化学染色仪器和试剂 免疫组化全自动染色机(美国 LAB VISION，AUTO STAINER 720)，单克隆一抗 ERCC1(NeoMarker公司，1∶350)、RRM1(ProteintechGroup，1∶500)、β-tubulinⅢ(BioGenex公司，1∶1000);ERCC1免疫染色所用二抗为PV-9000 Anti-Mouse/Rabbit(北京中杉生物技术有限公司)，RRM1及β-tubulinⅢ免疫染色所用二抗为EnVision Anti-Mouse/Rabbit(Dako公司)。

1.3 方法

1.3.1 胸腔积液/心包积液液基细胞薄片的制作［1］①将临床新鲜送检的浆膜腔积液静置15 min左右后取底层的液体(＞50 ml时)45 m l入50 ml离心管(为确保可制成多张含足量癌细胞的优质液基细胞薄片，建议临床多抽取或将引流的胸腔积液全部送检)。②用程控离心机程序3离心10 min(离心力为600 g)，对于含瘤细胞少的标本需多次取样离心收集细胞，直至灰白细胞团达20 ul以上方可(含瘤细胞过少且无法获取足够标本量者不宜做此实验)，去上清液后加入10 ml红色固定液(血性标本用吸管吸取瘤细胞层入红色固定液以去除过多的红细胞)。③将50 ml离心管再置离心机内用程序3离心10 min，去上清液后加入 pH 8.0的10 m l Tris缓冲液，振荡，经纱布过滤后将标本转移至12 ml离心管内。④用离心机程序4离心5 min，去除上清液后振荡，将聚集在管底细胞团振散、混匀，并视细胞团的大小加入适量的Tris缓冲液。⑤将盛有细胞的混悬液的12 ml离心管置于超柏TM Auto Cyte PREP液基细胞薄片自动制片机上，启动PrepStain系统 ，输入"NONGYN"进入非妇科制片系统，按照系统的操作提示输入参数进行液基细胞薄片程序化常规制片染色，先制作1张HE片，将余下的液基细胞混悬液置冷藏室。⑥将经HE诊断为NSCLC且含一定量瘤细胞的液基细胞混悬液重新放到制片机上，仍进入非妇科制片系统，按照制片要求输入参数，终止于常规HE染色前(为保证每例每张供免疫细胞化学的液基细胞片含有一定量瘤细胞且厚薄均匀适当，应根据HE片含瘤细胞的情况，调节好细胞混悬液的浓度，含瘤细胞较少的在制片过程中辅以手工将收集的所有细胞全部均匀地倒入各细胞沉降管内)，将制作好的液基细胞薄片收集待免疫细胞化学。

1.3.2 免疫细胞化学染色 液基细胞片入PBS缓冲液30 min后直接入免疫组化全自动染色机进行免疫细胞化学染色。ERCC1采用PV-9000法(一抗孵育60 min，PV-9000-1、PV9000-2分别孵育20 min，DAB显色6 min)。RRM1、β-tubulinⅢ 采用 En-Vision法(一抗孵育60 min，EnVsion Anti-Mouse/Rabbit二抗孵育30 min，DAB显色)。用PBS代替一抗作为阴性对照，用已知ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ阳性组织作为阳性对照。免疫细胞化学染色结束后，苏木精复染、中性树胶封固。

1.3.3 免疫细胞化学结果判断 ERCC1阳性定位于细胞核，RRM1及β-tubulinⅢ定位于细胞质。参照复旦大学附属肿瘤医院提出的结果判断标准［2］，首先将染色强度计分:0分为无色;1分为淡黄色;2分为棕黄色;3分为棕褐色。再按阳性细胞数占肿瘤细胞的百分比计分:无阳性细胞为0分;阳性细胞数占比≤10%为1分;11% ～50%为2分;51% ～75%为3分;＞75%为4分。将染色强度得分与阳性细胞百分比得分的乘积作为判断依据:0～3分为"-"，4～6分为"+"，7～9分为"++"，10～12分为"+++"。

2 结果

2.1 镜检

涂膜面积直径仅为1.3 cm的LCT细胞薄片，细胞分布均匀、红细胞大多破坏消失 ，涂片背景清晰、异常细胞清楚可见。细胞因采用湿固定且及时，细胞形态保存完好;免疫细胞化学染色的阳性定位准确可靠;背景干净，非特异性背景染色无或较轻，易于判读诊断。

2.2 免疫细胞化学表达结果

71例NSCLC胸腔积液癌细胞ERCC1、RRM1和 β-tubulinⅢ蛋白表达结果分别为:ERCC1阴性36例(50.7%)，阳性35例(49.3%);RRM1 阴性 52 例(73.2%)，阳性 19 例(26.8%);β-tubulin Ⅲ阴性 22 例(31.0%)，阳性49 例(69.0%)，见表1。

表1 71例NSCLC胸腔积液癌细胞ERCC1、RRM1和β-tubulinⅢ蛋白表达结果(例，%)

3 讨论

肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，其中NCSLC约占所有肺癌的80%，且多数患者确诊时已处于晚期，临床已失去手术治疗的机会，化疗是晚期NSCLC的主要治疗手段。然而NSCLC远不如小细胞肺癌对化疗敏感，化疗有效率低，患者长期生存率低。上世纪90年代以来，随着第3代化疗药物吉西他滨(gemcitabine，Gem)、去甲长春花碱(vinorelbine，NVB)、紫杉醇(paclitaxe，l TXL)和多西紫杉醇(docetaxe，l TXT)等的出现和应用，以铂类为基础新的联合化疗方案成为NSCLC的标准化疗方案，但是联合化疗有效率也只有30% ～40%，5年生存率仅改善5%左右［3］。同一种病理类型和分期的NSCLC用相同的方案及剂量化疗，在不同个体上疗效存在明显差异，使得化疗只对部分NSCLC患者有效，而大部分患者除了遭受化疗的毒副作用外并未获益［4］，此现象考虑与肿瘤耐药有关。

近年来国内外的大量研究显示［5～8］，ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ基因表达水平，分别与顺铂、吉西他滨、紫杉醇类/长春碱类耐药相关。联合检测这些标记可以初步预测该患者对某种药物的敏感程度及其预后，进而针对不同个体设计不同的化疗方案，以提高化疗疗效、减少不敏感药物给患者带来的不良反应，节约医疗资源。

然而，在国内外研究中所用实验材料基本上源自手术切除或活检的组织学标本，对于仅表现为癌性胸腔积液的晚期NSCLC已无法通过手术获取标本，因此如何使这部分患者获得满意的样本材料，并进行上述耐药基因检测是实际工作中迫切需要解决的问题。通过胸腔穿刺/心包穿刺直接抽取积液标本获取瘤细胞容易、快捷、经济，对患者创伤小，可重复性强，但传统的方法手工涂片制出的细胞片，厚薄不匀、背景不清、尤其是血性胸腔积液/心包积液瘤细胞收集较难，背景过深，难以做出理想的免疫细胞化学片，标记结果判读困难。我们将收集的71例恶性胸腔积液/心包积液用LCT技术进行细胞制片，杜绝了传统手工细胞涂片的诸多不足。制出的液基细胞薄片，面积小(直径仅为1.3 cm)，背景清晰、红细胞大多被去除、癌细胞数量多、分布均匀，标本因及时采用湿固定法，细胞形态及抗原分子保存良好。经免疫细胞化学标记的细胞片阳性定位准确，背景干净，非特异性背景染色无或较轻，易于判读，其结果与组织学切片的免疫组织化学结果基本一致。因此我们认为对表现为胸腔积液或心包积液的晚期NSCLC患者可抽取积液，经常规细胞学检查明确诊断后，采用液基细胞学制片技术检测以获得合格的ERCC1、RRM1、β-tubulinⅢ等免疫细胞化学检测需要的标本，从而实现对化疗药物敏感性的预测，为患者实施个体化治疗。

［1］ 陶 玉，何 松，吉志固.液基细胞学技术在非妇科标本中的应用体会〔J〕.临床与实验病理学杂志，2009，25(5):559.

［2］ 许良忠，杨文涛.免疫组织化学反应结果的判断标准〔J〕.中国癌症杂志，1996，6(4):229.

［3］ Arriagada R，Bergman B，Dunant A，et al.Cisplatin based adjuvant chemotherapy in patients with completely resected non-small-cell lung cancer〔J〕.N Engl JMed，2004，350(4):351.

［4］ Rosell R，Cecere F，Santarpia M，etal.Predicting the outcome of chemotherapy for lung cancer〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2006，6(4):323.

［5］ Olaussen KA，Ariane D，Fouret P，etal.DNA repair by ERCC1 in nonsmall-cell lung cancer and cisplatin-based adjuvant chemotherapy〔J〕.N Engl JMed，2006，355(10):983.

［6］ Bepler G，Kusmartseva I，Sharma S，etal.RRM1modulated in vitro and in vivo efficacy of gemcitabine and platinum in non-small cell lung cancer〔J〕.JClin Oncol，2006，24(29):4731.

［7］ 江 波，赵金奇.RRM1与非小细胞肺癌吉西他滨化疗耐药相关性的研究进展〔J〕.实用癌症杂志，2010，25(5):544.

［8］ Gan PP，Pasquier E ，KavallarisM.ClassⅢ beta-tubulinmediates sensitivity to chemotherapeutic drugs in non-small cell lung cancer〔J〕.Cancer Res ，2007，67(19):9356.