体外培养的脐血间充质干细胞的生物学特性及影响因素

王正辉等

脐血间充质干细胞是一类从脐带血中分离和培养的成体干细胞，具有高度自我更新和多向分化的潜能。脐血间充质干细胞的这些特性，吸引了众多国内外学者的目光，目前，脐血间充质干细胞移植的临床治疗取得了一定进展。本文就脐血间充质干细胞的采集分离、纯化及生物学特性及研究前景作一简要综述。

脐带血是指胎儿娩出，脐带结扎，残留在脐带和胎盘靠近胎儿段内的血液。脐带血中含有两种干细胞：造血干细胞（Hematopoietic stem cells，HSCs）和间充质干细胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）。脐带血造血干细胞异体移植后发生免疫排斥反应的可能性极低[1]，它已应用于临床治疗，主要用于治疗造血系统疾病（白血病、恶性淋巴瘤、骨髓瘤）、糖尿病、肝脏疾病等。间充质干细胞具有高度的自我更新和多向分化的潜能，这些特性近年来引起了国内外众多研究者的广泛关注。Lee等[2]将冷藏0.1～5年的脐血单个核细胞培养3～5周，获得贴壁的细胞呈现成纤维细胞样形态，并具有间充质细胞的免疫表型，表明可以长期冻存保存脐血间充质干细胞。2000年，Erices[3]首次报道脐血中含有间充质干细胞，其形态和免疫学表型和骨髓间充质干细胞相似。Karen [4]认为脐血间充质干细胞分离成功的关键在于：①从脐血中采集分离时间不超过15h；②脐血的量不少于33ml；③单个核细胞量不少于1×108个。但脐血间充质干细胞分离成功率低[5-6]，甚至有些学者认为脐血中没有间充质干细胞[7-9]。且随着胎龄的增加，脐血间充质干细胞的数量、生长活性及分离培养的成功率逐渐下降。

1影响脐血间充质干细胞分离培养成功的因素

1.1 脐血的采集量：个体差异较大，与产妇分娩的方式、采集者操作水平等因素有关，脐血采集量越大、分离的成功率越高。

1.2采集到分离的时间：要求24h内完成分离接种，时间越短分离培养的成功率越高。

1.3 分离方法及培养条件的优化：目前脐血间充质干细胞的分离，完全套用骨髓间充质干细胞的分离方法，这可能是导致脐血间充质干细胞分离成功率低的重要原因之一。国内外众多学者对脐血间充质干细胞培养条件进行优化，但由于条件的限制，尚无统一的评价标准，难以进行比较。

1.4首次接种密度：接种密度过大，细胞接触抑制，生存空间不足，培养基中的营养成分消耗过快；密度过低无法形成细胞生长所需的环境或者原代细胞发生老化。

1.5血清浓度：文献报道血清浓度10%～20%，一般认为低浓度血清更利于脐血间充质干细胞生长，高浓度的血清含有大量促进细胞增殖的因子，细胞增殖迅速，容易过早发生老化。胎牛血清中异种蛋白随脐血间充质干细胞移植入人体后会增加细胞毒性反应或者免疫排斥反应的风险。国内有报道，通过从脐血中分离自体血清成功培养出脐血间充质干细胞，可以大大降低免疫反应；但自体血清量少，则难以支持脐血间充质干细胞长期大量扩增。

1.6 细胞因子的使用：可以向纯化后的脐血间充质干细胞中添加bFGF、EGF、GM-CSF、IL-3 等细胞因子[10]。

1.7 pH值：偏酸性的环境抑制造血干细胞及破骨样细胞的生长，有利于脐血间充质干细胞的纯化。

2脐血间充质干细胞的分离方法

2.1密度梯度离心法：为提高单个核细胞分离的成功率，目前多采用自然沉降与密度梯度离心相结合的方法。加速红细胞沉降，可以向脐血中加入大分子物质，如：明胶[12]、羟乙基淀粉、甲基纤维素等，也可以通过红细胞裂解液氯化铵去除红细胞。干细胞的密度与单个核细胞密度基本相同，在高速离心条件下通过分层液Ficoll或Percoll将单个核细胞从脐血中分离出来。该方法操作简单，获得的MSCs量可以满足体外培养所需细胞密度要求。

2.2 贴壁培养法：体外培养的脐血间充质干细胞有贴壁生长的特性，但该方法提取的细胞纯度不足，可有大量红细胞、巨噬细胞、破骨样细胞等细胞成分。多次传代后仍可见杂质细胞，对间充质干细胞增殖有一定影响。目前多主张将密度梯度离心与贴壁培养方法相结合，可获得较理想的分离效果。

2.3 免疫磁珠分选：表面包被抗体的磁珠与表面标志抗原特异性结合，通过正选或负选将脐血间充质干细胞分离出来。该方法对细胞活性影响较大。

2.4流式细胞仪分选：将干细胞大小和表面标记进行分离，获得的细胞纯度高。免疫磁珠和流式细胞仪分选的方法，对脐血量要求大、抗体价格昂贵，对脐血间充质干细胞的活性影响较大，不适合实验室推广。

2.5 单细胞克隆方法：该方法技术要求较高，难以获得大量的脐血间充质干细胞。

3脐血间充质干细胞的培养

脐血间充质干细胞适合在偏酸性的环境中生长，目前常用的培养基有DMEM/F12、LG-DMEM、α-MEM、IMDM培养基。一般认为间充质干细胞专用Mesencult TM 培养基培养功率较高，但该培养基价格昂贵限制其广泛地使用。如：Both 等[13]用α-MEM 培养基、低密度接种培养MSCs 优于高密度下DMEM 培养基培养，添加地塞米松能促进细胞生长；Yang 等[14]采用含10%胎牛血清的α-MEM 培养基仅有23%的标本成功培养出MSCs；Liu 等[15]以l×l07cells/cm2 接种密度于含有20%FBS 的IMDM 培养基中，结果144份脐带血中有108份通过原代培养成功地培养出间充质干细胞，占总数的75%。加入人碱性成纤维细胞生长因子 bFGF、人表皮生长因子EGF、粒-巨噬细胞集落刺激因子GM-CSF、 IL-3等细胞因子[16]对UCB-MSC的生长起促进作用。优化培养可以使原代培养的成功率达到90%以上。目前认为细胞因子作为蛋白质大分子物质，通过结合与作用于受体的胞外域来激活细胞表面受体，并能够识别与结合化学信号，触发靶细胞产生特异的生理效应。但这些细胞因子通过何种途径进行细胞间的信号转导，其机制尚还没有突破性研究。

4脐血间充质干细胞的鉴定

4.1形态学观察：原代脐血间充质干细胞初贴壁时呈圆形或椭圆形，散在分布，双侧伸出突起。折光性较强，突起伸长后呈现单个核的梭形。5～7天可见多个细胞相互聚集形成集落，原代细胞表现为异质性可见梭形、多角形、不规则形状。镜下可以观察到体积较大，多个核的破骨样细胞，体积较小呈圆形的细胞，多个突起的、不规则形态的树突状细胞。3～4周后细胞生长至80%～90%融合时按1：3进行消化传代。传代后的脐血间充质干细胞4～6h开始贴壁，增殖迅速，1周左右可达到80%～90%融合。三代以后细胞形态均匀，梭形的细胞呈漩涡状或者火焰状生长。

4.2 免疫表型的鉴定：目前认为MSCs表面抗原无特异性，既有间质细胞，又有内皮细胞及上皮细胞的特征。迟作华[17]总结了脐血间充质干细胞表达的主要分子包括：①粘附分子：CD54、CD51、CD44、CD13等；② 整合素家族成员：CD49b、CD49e、CD29等；③ 其他：CD90（Thy1）、SH2（CD105）、HLA-ABG、ASMA、SH13（CD166，ALCAM）、SH4（CD73）等。但不表达造血细胞表面标志，如：CD45、CD34、CD14、CD3、CD4、CD8、CD2、CD15、CD16、CD19、CD24、CD33、CD38、CD133、CD135（FH-3）、CD117（e-kit）、glycophorin A等也不表达与人白细胞抗原（HLA）识别有关的共刺激分子B7-1、B7-2及主要组织相容性复合物Ⅱ类分子，如HLA-DR等。

5面临问题

脐血间充质干细胞分离成功率低，培养周期长，难以建立稳定纯化的细胞系从而实现体外的大量扩增[18]；个体差异较大，尚无统一的体外分离培养标准；缺乏特异的鉴定标记，目前主要通过细胞的形态和非特异表型进行鉴定；定向诱导分化的方法和机制，以及分化后功能能否发挥及如何保持有待深入研究；细胞因子对细胞增殖分化的作用及相互之间存在的影响；确定HLA配型不符的最低标准，以扩大供体的来源；移植治疗的最佳时机、剂量。相信随着对脐血间充质干细胞研究的深入，这些问题终将解决，使脐血间充质干细胞更广泛地应用于基础研究和临床治疗。

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[收稿日期]2012-05-04 [修回日期]2012-06-25

编辑/李阳利