创愈生肌散对糖尿病大鼠模型慢性创面的治疗作用研究

张子茜等

[摘要]目的：观察以中药传统方剂生肌散为基础的改良新药创愈生肌散对糖尿病大鼠模型慢性难愈创面的治疗作用。方法：对糖尿病大鼠模型慢性难愈创面经随机分组后给予外用创愈生肌散和rb-bFGF，以未作处理的创面作为空白对照。分别在伤后第1、4、7、10、14和21天观察各组慢性难愈创面的愈合情况，使用Real time PCR方法检测各时间点慢性难愈创面中VEGF、HIF-1α以及Ang1基因的表达情况。结果：在糖尿病性慢性难愈创面模型中，创愈生肌散组糖尿病性慢性难愈创面的愈合时间为（21.3±2.1）天，rb-bFGF组创面的愈合时间为（23.2±2.4）天，对照组创面的愈合时间为（26.8±2.8）天，差别有统计学意义（P<0.05）。使用Real time PCR方法检测发现，创愈生肌散组的创面标本中的VEGF、HIF-1α以及Ang1表达量明显高于其他两组，差别有统计学意义（P<0.05）。结论：使用创愈生肌散可明显缩短糖尿病性慢性难愈创面的愈合时间，创愈生肌散可通过上调VEGF、HIF-1α以及Ang1等与新生血管密切相关的基因表达而促进创面中的血管生成。

[关键词]创愈生肌散；大鼠；糖尿病；慢性难愈创面

[中图分类号]R622R332[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）08-1334-03

创面是正常皮肤组织在外界致伤因素及机体内在因素如营养不良、缺氧和感染等作用所导致的损害，表现为破坏皮肤完整性及丢失正常组织形态及功能。通常将4～6周不愈合的创面称为慢性难愈创面，大多需要长时间的治疗，每年创面处理的医疗费非常高。伴随我国人民生活水平提高和人口逐步老龄化，糖尿病的发病率逐年上升，伴随而来的糖尿病性慢性创面的发生率越来越高，除了影响患者生活质量，治疗不及时的慢性创面经常致残、致畸[1-2]。大量实验已证明慢性难愈创面愈合的核心问题之一是局部血运不良，创面愈合血管化延迟，因此，寻找促进创面愈合的血管化的新药十分必要[3]。目前临床上使用各类生长因子，但是临床试用效果并不理想，且存在价格昂贵、半衰期短、基因治疗的不成熟性等问题。然而，千百年来，祖国医学的中药外用对创面愈合却具有独特疗效。因此，充分发挥外用中药有效促进创面愈合的特长，系统研究药物作用机理具有重要的意义。

创愈生肌散是由第四军医大学西京医院根据中药传统方剂生肌散改良而来的新型中成药制剂，该药物在药理上具有止血、消肿、消炎、促进伤口愈合，治疗各种烧烫伤、外伤有效的方法功效，在对犬的大、中、小型切口模型中，创愈生肌散能明显缩短创面愈合时间，降低创面感染率，促进愈合[4-5]。

为了研究创愈生肌散对慢性难愈创面的治疗功效和相关机制，本实验通过构建糖尿病慢性难愈创面动物模型，与rb-bFGF和空白对照相比，观察使用创愈生肌散后慢性难愈创面动物模型的创面愈合情况。并且采用分子生物学的方法，检测血管形成及相关分子的表达，深入探讨创愈生肌散促进慢性难愈性创面愈合血管化的分子机制。

1材料和方法

1.1 实验动物及试剂：本实验使用SD大鼠均为雄性，8～10周龄，150～200g，由第四军医大学实验动物中心提供。Real time PCR试剂盒为日本TaKaRa公司产品；VEGF单抗、HIF-1α单抗和Ang-1单抗为武汉博士德公司产品；rb-bFGF为珠海亿胜生物制药有限公司产品。

1.2 Ⅱ型糖尿病大鼠模型的构建： 54只SD大鼠均喂以高糖高脂饲料，配方为基础饲料66.5%、蔗糖20%、猪油10%、胆固醇2.5%、胆酸盐1%、奶粉4%、鸡蛋1.5%；饥饿12h（过夜禁食，不禁水）后，按照40mg/kg体重的比例，从尾静脉注射pH4.5、0.1mol/L柠檬酸缓冲液配制的1%链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）；实验过程中检测各组随机血糖及空腹血糖、葡萄糖耐量；于造模第4周和第8周对所有的大鼠行葡萄糖耐量实验；糖尿病大鼠模型建成标准为：大鼠禁食12 后以50%葡萄糖溶液灌胃后血糖峰值16.7mol/L、120min血糖达到11.1mmol/L、且体重明显下降（>50g）。

1.3 慢性难愈性创面的构建：将确认建模成功的SD大鼠使用盐酸戊巴比妥钠（100mg/kg）腹腔注射麻醉；腰椎正中偏上剪毛并在造模区标记相同的2cm×2cm的造模面积；在无菌条件下，沿脊椎方向用外科方法作切取全等皮肤，建立全层皮肤缺损开放性创面模型；创面加盖两层消毒干纱布，医用胶布固定，造模后每只大鼠连续3天后肢肌肉注射青霉素40万U预防感染。

1.4 实验分组及药物使用：SD大鼠54只，按照体重随机分为3组：创愈生肌散组、rb-bFGF组以及空白对照组各18只；创愈生肌散组SD大鼠每日创面消毒后，生理盐水冲洗创面，创愈生肌散（第四军医大学西京医院药剂科，兰制字2006F68129）1g直接敷于创面，每日两次； rb-bFGF组SD大鼠创面每日消毒后，生理盐水冲洗后，按150AU/cm2剂量将药物直接喷于创面，表面纱布包扎固定，每日两次；对照组：创面清创消毒后，每日换药两次，不给于任何药物；分别于术后1、4、7、10、14、21天观察记录各组大鼠的创面愈合情况，计算局部创面愈合率，并处死大鼠，并以每个创面为中心，切取2.2cm×2.2cm大小组织（含全部创面）用于实时PCR检测。

1.6 Real time PCR检测：按照TaKaRa公司Real time PCR检测试剂盒操作说明进行，在ABI 7500型实时荧光定量PCR仪上进行反应，所有实验重复三次。

1.7 统计学方法：采用统计学软件SPSS 13.0，以方差分析检验各组均数问的差异，如果差异有统计学意义，S-N-K检验进一步行多重比较。

2结果

3讨论

本研究利用链脲左菌素实验性糖尿病动物模型用于模仿糖尿病慢性难愈创面，虽然转基因型和自发型糖尿病模型已应用于研究领域，但是来源较少，饲养条件高、价格昂贵，难于大规模的广泛普及应用。目前链脲左菌素实验性糖尿病动物模型是应用最为广泛的实验性糖尿病动物模型，具有技术成熟、成功率高和成本低等优点。利用该模型构建糖尿病性慢性难愈创面，并分别给予创愈生肌散和rb-bFGF，观察两种药物对创面愈合的影响。并且使用分子生物学方法检测创面标本中VEGF、HIF-1α和Ang1的表达以及微血管密度。

经过观察，创愈生肌散组糖尿病性慢性难愈创面的愈合时间与rb-bFGF组和对照组相比明显缩短，差别有统计学意义（P﹤0.05）。通过计算创面愈合率发现，创愈生肌散组的糖尿病性慢性难愈创面的愈合率明显高于其他两组，说明使用创愈生肌散可明显促进糖尿病性慢性难愈创面的愈合。Real time PCR和免疫组织化学染色结果发现，糖尿病性慢性难愈创面给药后第1天、4天、7天和10天，创愈生肌散组难愈创面标本中的VEGF、HIF-1α和Ang1的表达明显高于rb-bFGF组和对照组，而第14天和21天三组之间则无明显差异。说明创愈生肌散有明显的上调VEGF、HIF-1α和Ang1表达的作用。以上结果说明创愈生肌散可通过上调与新生血管关系密切的基因表达如VEGF、HIF-1α和Ang1促进糖尿病性慢性难愈创面中的血管发生，进而加速糖尿病性慢性难愈创面的愈合。本研究结果将为临床广泛应用生肌类中药提供理论依据，也能够为今后研究中西医结合的治疗方法提供方向，并将会促进祖国传统中医药在国际上的竞争力。

[参考文献]

[1]Baumgartner M，Tanner D，Hunziker T.Local treatment of chronic skin wounds in a Swiss out-patient wound centre 2010[J].Ther Umsch，2011，68：153-158.

[2]Gualdi G，Monari P，Farisoglio C，et al. Nested graft in chronic wounds： a new solution for an old problem[J].Int Wound J，2011，8：127-31.

[3]Percival SL， Hill KE， Malic S，et al. Antimicrobial tolerance and the significance of persister cells in recalcitrant chronic wound biofilms[J].Wound Repair Regen， 2011，19：1-9.

[4]刘玉林，孙志峰，刘子冬，等.创愈生肌散促进全创伤愈合效果的药效研究[J].陕西中医，2009，30（7）：918-919.

[5]王芳，李雪晴，刘玉林，等.创愈生肌散质量标准的研究[J].中国医院药学杂志，2010，30（1）：80-81.

[6]Lerman OZ， Galiano RD， Armour M，et al.Cellular dysfunction in the diabetic fibroblast： impairment in migration，vascular endothelial growth factor production， and response to hypoxia[J].Am J Pathol，2003，162：303-312.

[7]Catrina SB，Okamoto K，Pereira T，et al.Hyperglycemia regulates hypoxia-inducible factor-1α protein stability and function[J].Diabetes，2004，53：3226-3232.

[8]Brem H，Tomic-Canic M，Entero H，et al.The synergism of age and db/db genotype impairs wound healing[J].Exp Gerontol，2007，42：523-531.

[9]Botusan IR，Sunkari VG，Savu O，et al.Stabilization of HIF-1α is critical to improve wound healing in diabetic mice[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105：19426-19431.

[10]Wang GL，Semenza GL.General involvement of hypoxia-inducible factor 1 in transcriptional response to hypoxia[J].Proc Natl Acad Sci U S A. 1993；90：4304-4308.

[11]Mace KA， Yu DH， Paydar KZ，et al.Sustained expression of HIF-1α in the diabetic environment promotes angiogenesis and cutaneous wound repair[J].Wound Repair Regen，2007，15：636-645.

[12]Gregg L.Semenza. Vascular Responses to Hypoxia and Ischemia. Arterioscler Thromb Vasc Biol，2010，30（4）：648-652.

[收稿日期]2012-04-11[修回日期]2012-06-28

编辑/张惠娟