向日葵食用蛋白的提取和SDS-PAGE电泳技术研究

刘宇新,靳力争,张仲国,鲁福成,苏丽娜

摘要：以向日葵种子为材料，采用SDS-PAGE电泳技术，以不同电泳条件对23种向日葵食用蛋白进行电泳谱带分析试验，研究不同电泳条件下向日葵食用蛋白的谱带变化，以选择出最佳的电泳条件。结果显示，最佳试验条件为：按照质量与体积比1∶3的比例用去离子水在4 ℃条件下30 min提取水溶性蛋白。电泳时，在4 ℃条件下进行，凝胶板厚度1 mm，分离胶浓度8%，浓缩胶浓度5%，电压300 V，加样量控制在10 μL。

关键词：向日葵；种子贮藏蛋白；聚丙烯酰胺凝胶电泳；品种纯度

中图分类号：S565.503.2文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2012.02.003

Technical Study on the Edible Protein Extraction from Sunflower and Protein Analysis with SDS-PAGE Electrophoresis

LIU Yu-xin1, JIN Li-zheng1, ZHANG Zhong-guo1, LU Fu-cheng1, SU Li-na2

(1. Tianjin Horticultural Engineering Institute，Tianjin 300384，China; 2.Tianjin Academy of Agricultural Sciences, Tianjin 300192, China)

Ａｂｓｔｒａｃｔ: Taking sunflower seeds as materials, with different electrophoretic conditions, 23 kinds of edible sunflower protein electrophoresis band were analyzed by SDS-PAGE electrophoresis, in order to study the variations of electrophoresis protein bands of edible sunflower under different conditions and choose the best electrophoretic conditions. The results showed that optimum conditions were: according to the ratio of weight and volume 1∶3, deionized water was used at 4 ℃ for 30 min to extract soluble proteins. Electrophoresis was done at 4 ℃ under the conditions of the gel thickness 1 mm, gel concentration of 8%, 5% stacking gel concentration, voltage 300 V, plus sample volume 10 μL.

Key words: sunflower;seed storage protein;polyacrylamide gel electrophoresis;varietal purity

向日葵种子是优质食用油和优质蛋白质的重要来源之一[1]。它含有球蛋白、清蛋白和油脂体蛋白等丰富的蛋白质。目前，关于向日葵的蛋白分离、鉴定工作较少。Kumar等[2]运用SDS-PAGE电泳对向日葵的杂交种进行对比分析, 并对杂种一代的遗传纯度进行鉴定。谢宗铭等[3]采用SDS-PAGE电泳分离大量向日葵种子蛋白, 并将其应用于自交系和杂交种的鉴定, 获得良好效果。

食用蛋白即种子贮藏蛋白。自70年代以来,蛋白质电泳技术开始应用于种子品种鉴定和纯度检验,并得到迅速推广。国外研究多以高蛋白含量葵花籽为原料, 采用石油醚脱脂后再分离蛋白质[4]，笔者从不同品种向日葵种子的微量样品中获得蛋白质,并利用SDS-PAGE电泳分离技术研究蛋白含量和种类的差异。本试验对向日葵种子贮藏蛋白的最佳提取方法和最佳SDS-PAGE电泳条件的确定及SDS-PAGE电泳技术在向日葵品种鉴定上的应用进行了研究。

1材料和方法

1.1试验材料

食葵：龙食葵、祥和；油葵：HA300(2002)、天龙黑油、2603、A01-6-7、89By-14、AS04-2、AS03-1-1、A04-5-3、PR29-9、PR29-8、PR29B、PR29-0607、HA89、td黑、吉35、HA300-55（C）、康地5号、89By-15、AS03-6-7、89By、长城T012244。

1.2试验试剂

丙烯酰胺、N，N-亚甲双丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠(SDS)、过硫酸铵(AP)、TEMED、Tris、甘氨酸、溴酚蓝、甘油、考马斯亮蓝R-250、无水乙醇、冰乙酸。

1.3试验方法

（1）样品预处理。取每种种子2粒，粉碎研磨成细末。将粉碎样品分别装于1.5 mL离心管中，称质量，按种子∶双蒸水=1∶3的量加水，将处理好的EP管放入4 ℃冰箱静置30～60 min提取蛋白。

（2） 总蛋白质的提取。将静置好的蛋白EP管放入离心机中，4 ℃，1 000 rpm，离心10 min，准备相同数目的EP管标记备用，吸取上清转移至备用EP管中，按1∶1加入上样缓冲液，沸水中煮沸5 min，将处理后的EP管放入-20 ℃冰箱备用。

2结果与分析

2.1蛋白质提取分析

2.1.1蛋白质类型的确定向日葵食用蛋白根据溶解特点的不同，分为水溶性、盐溶性和醇溶性。不同溶解特性的蛋白在含量和电泳条带的特性上有很大的区别。通过对3组电泳条带分析，根据表1可以看出，不同的组合其电泳条带各有不同，其中水溶组电泳条带表型最佳，适用于蛋白分析，选择水溶性蛋白进行分析。

2.1.2水溶性蛋白最佳提取方法的确定选择4种方法对水溶性蛋白进行提取，经相同条件电泳后，根据表2可以看出，方法二提取的蛋白经电泳后，谱带数与其余3种接近，但谱带扩散和拖尾现象严重，干扰正常分析。从简化实验操作的角度，选择方法三为最佳提取方法。

2.2 电泳条件分析

2.2.1不同凝胶板厚度对电泳的影响试验分别选用1 mm和1.5 mm两种厚度的凝胶板电泳槽，经相同品种和相同条件下电泳后比较，发现1 mm厚度的胶板在蛋白谱带的效果和染色方面的表现均好于1.5 mm厚度的胶板，经分析，选用1 mm厚度的凝胶板最佳。

2.2.2不同分离胶浓度对电泳的影响试验分别选用浓度为8%，10%和12%的分离胶，经相同品种和相同条件下电泳后比较发现，凝胶浓度越高，电泳时间越长，电泳谱带丢失越严重，经分析，选择8%浓度的分离胶最适宜（表3）。

2.2.3不同加样量对电泳的影响试验分别选用5，10，15 μL 3种加样量，经相同品种和相同条件下电泳后比较发现，浓度过低，电泳谱带不清晰且有部分丢失，浓度过高，电泳谱带过宽且重叠，经分析选择10 μL的加样量最佳（表4）。

2.3蛋白电泳分析

向日葵食用蛋白凝胶电泳谱带根据分子量大小可划分为а、β、γ3个区域。а区为小分子量蛋白质,该区域谱带数量少，谱带扩散，染色浅，品种间差异不太显著，在蛋白分析中作为次谱带区域。β区为中分子量蛋白质,该区域中谱带数量多，染色深，品种间差异显著，在蛋白分析中作为主谱带区域。γ区为高分子量蛋白质，该区域谱带数量多，染色谱带细，品种间差异小，最好不作蛋白分析用。

通过对电泳图谱的分析看出，向日葵水溶性蛋白可分离出20条左右的谱带，且具备多态性，各品种间的蛋白谱带在条带的有无、颜色的深浅、宽度上均存在不同程度的差异。从图1可看出，AS04-2、AS03-1-1、AS04-5-3在β区存在差异，与AS03-1-1相比，AS04-2少3条谱带，而AS04-5-3则少2条谱带。同样，在PR29-8和PR29-9间也存在差异，PR29-8比PR29-9在β区少一条谱带，且有一条相同迁移率的谱带在颜色上有明显的差异。

3讨论

目前,蛋白质组学研究越来越受到人们的关注,成为后基因组时代的重要研究领域之一[5]。电泳作为一种快速、简单、高效分离种子蛋白的方法,近年来得到广泛应用[6-7]。前人曾报道从单粒向日葵种子中提取向日葵蛋白质用于单向电泳鉴定自交系和杂交种取得成功[8]。从微量样品提取蛋白质的方法可以做到快速、节省样品及节约成本。Karine等[9]用少量拟南芥样品(10 mg)进行了双向电泳分析。

本研究初步确定了向日葵种子蛋白的最佳提取方法：醇溶法加样时蛋白不下沉使加样困难，盐溶法提取蛋白不多，水溶法提取2S水溶蛋白最好。初步确定了SDS-PAGE电泳最佳条件：电泳缓冲液pH值 8.3，4 ℃，凝胶板厚度1 mm，分离胶浓度8%，浓缩胶浓度5%，电压300 V，加样量控制在10 μL。初步进行了不同品种向日葵食用蛋白的电泳谱带分析。不过,这些蛋白质的结构及其功能有待于进一步深入研究, 例如通过氨基酸分析, N端测序或质谱分析, 确定其序列、种类, 再结合图像分析,进一步明确它们的生理生化功能[10]。

参考文献：

[1] William A. Value of sunflower seed meal related to fiber protein content[J] . Feedstuffs, 1999, 71( 41) : 11-12.

[2] Kumar J, Agraw al R L, Kumar A, et al. Sodium dodecyl sulphate- polyacrylamide gel electrophoresis analysis for determination of genetic purity of sunflower hybrid[J] . Seed Science and Technology, 2001, 29(3) : 647-652.

[3] 谢宗铭,陈福隆,孙宝启.种子蛋白乳酸尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳技术及其对向日葵自交系和杂交种的鉴定[J].中国油料作物学报,1999,21(3):30-33.

[4] 任健，郑喜群,刘晓兰，等.葵花粕中2S清蛋白的分离制备及性质研究[J].粮油加工，2007,7(3):81-83.

[5] Stanley F, Yuji, David J L. Functional genomics[J] . Proc Natl Acad Sci, 1999, 96: 8825 - 8826.

[6] 常胜合，舒海燕，秦广雍，等. 凝胶电泳蛋白质染色方法研究进展[J]. 河南农业科学，2006（5）：8-12.

[7] 王洁，闫米格. 蛋白质凝胶电泳鉴定杂交玉米种子纯度与田间种植鉴定法的相关性研究[J]. 山西农业科学，2009，37（4）：41-43.

[8] Flengsrud R. Separation of acidic barley endosperm proteins by two - dimensional electrophoresis [J] . Electrophoresis, 1993, 14: 1060-1066.

[9] Karine G, Claudette J, Steven P C, et al. Proteomic analysis of arabidopsis seed germination and pr iming [J] .Plant Physiol, 2001, 126: 835- 848.

[10] 董贵俊, 张卫东, 刘公社.向日葵种子蛋白质的微量提取和双向电泳技术研究[J] .中国油料作物学报，2004,3(4):22-25.