猪附红细胞体病的实验室检测方法研究

刘桂丽

摘 要:猪附红细胞体的检测方法,包括光学显微镜检查、电子显微镜检查、补体结合试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验、荧光抗体试验、聚合酶链式反应、DNA重组探针技术、DNA杂交技术、原位杂交技术等,为快速、准确地诊断附红细胞体病提供了参考。这种疾病一旦流行发生,会引起大量猪死亡,且诊断十分困难,随着研究的深入发现其是人畜共患的疾病,将是近段时间研究的热点。

关键词:附红细胞体病实验室检测方法研究

中图分类号:S8 文献标识码:A 文章编号:1674-098X(2012)07(c)-0024-01

山东省沂源县立足山草资源大力发展畜牧养殖业,成为当地农村经济发展支柱产业,其中养猪业发展成为畜牧养殖业的龙头。但近年来猪附红细胞体病呈大面积暴发流行,给养猪业造成严重的经济损失。该病是猪红细胞感染附红细胞体病毒引起的流行性病害,临床以贫血、黄疸和发热为主要症状,常与其他疾病同时发生,外部表现为体重增加速度慢,饲养周期长,种猪性能力测定下降,甚至丧失,且常规诊断比较困难。为了进一步让人们认识和了解这种疾病,更有效的预防此类的疾病,就猪附红细胞体病的临床症状和一系列的检测方法简单介绍一下。

1 猪附红细胞体病的流行病学

我们查阅了国内外大量资料发现该病多发生于温暖季节,夏秋多雨季节最易发病,常呈地方流行性。据我们对全县大型养殖场调查,怀孕的母猪最容易得病,哺乳期的仔猪死亡率最高,从调查数据看该病害可感染任何日龄的猪,表现隐性感染。由于该病是隐性感染,造成此病流行发生的途径如下:(1)外来的感染病猪。(2)防疫、注射被血液污染的针头,阉割时等被污染的剪刀等手术器械。(3)传病介质传播。如寄生于体表的血虱、疥螨、蚊蝇等吸血的节肢动物传播。(3)配种传播。交配时的互相传播。

2 猪附红细胞体病临床症状

我们近几年观察在哺乳前期,由于无法由食物中获取造血成分——铁质,仅能由日粮以及铁剂的注射来补充铁质,然而这样的铁质含量对于患猪附红细胞体的仔猪是不够的,因此小猪常常会有皮肤无血色、贫血以及黄疸等的症状。怀孕母猪:可分为急性以及慢性感染两种,急性的症状有厌食、发烧(40～41.7℃)厌食可长达1～3天之久,发烧通常发生在分娩前的母猪,持续至分娩过后,有时母猪也会有乳房以及阴部水肿的症状出现。分娩过后,母猪的产乳量降低,母性缺乏,所产下的仔猪发育不良,若无治疗,母猪可于分娩后的第三天后自然痊愈。慢性感染的症状包括了配种成功率的降低、乏情、轻微贫血以及受孕率降低等。少数猪发病10d左右出现急性死亡,死亡时口腔出血,解剖胃出血。患该病精神差,喜卧,高热,大部分发病猪全身皮肤发红,个别猪中、后期皮肤黄染或苍白,怀孕母猪出现流产、早产,尤其是导致母猪的流产率、早产率、死胎率增高,有的即使产活仔,仔猪弱小,发病死亡率高。

3 猪附红细胞体病剖检及病理变化

我们观察发现病猪全身皮肤红紫指压不褪色,以耳、鼻、腹部严重,经血液化验多为缺铁性贫血,常表现黄疸,眼膜黄染或苍白。我们课题组经五年的剖检发现病猪血液稀薄、色淡、放血后不易凝固;有胸水、心包积水、心外膜和心冠脂肪有出血点;胆囊膨胀、胆汁粘稠;脾脏微肿、有黑色出血点;肺脏、肾脏、淋巴结肿胀,有出血;淋巴结比正常猪质地柔软,作切面发现有灰白色坏死灶或出血斑点,切面有汁呈土黄色。

4 检测方法

我们采用实验室血涂片直接观察法、血涂片染色观察法、电镜观察法、免疫学方法四种检测方法对病猪血浆进行大量检测观察,具体操作方法如下。

4.1 血涂片直接观察

取抗凝血1滴制作常规载玻片。放大400～600倍即可见震颤和变形的血球。放在油镜下观察红细胞内和血浆中可见呈现绿色荧光的球形、逗号形、条形、网球拍形或细小颗粒状的附红细胞体。

4.2 光学显微镜检查

采用血涂片进行姬姆萨氏染色法染色,放在油镜观察,呈红色的是红细胞,呈深蓝色是附红细胞体。

4.3 电子显微镜检查

扫描电镜下可以发现,附红细胞体大小不等,以球形为主的多形小体,直径多为0.3～2.0微米,最大可达2.6微米,偶见短杆状、半月形等不规则小体。附着有附红细胞体的红细胞变形严重,但不进入红细胞内,可以单独存在,也可以成簇寄生,体形较大的附红细胞体可见纤丝,其纤丝可扒嵌在红细胞表面,但其仅仅附着在红细胞表面。

4.4 免疫学方法

4.4.1 间接血凝试验

Smith等将分离的附红细胞体作为检测抗原;从接种附红细胞体康复猪体内获得作为检测用抗体,用双向琼扩检测其抗原抗体特异性后进行IHA试验,结果接种效价达到1∶40以上,目前此种方法是一种常用的免疫学检测方法,此法能在一定程度上检测出潜在感染病猪。

4.4.2 酶联免疫吸附试验

此法灵敏性较IHA高,可用于快速诊断,提高了检测出潜在感染猪的几率,特异性试验表明与胸膜肺炎、巴贝丝虫、放线杆菌等无交叉反应,因此此法是目前用于检测猪附红细胞体病一种常用的方法。

4.5 DNA重组探针技术

根据16SrRNA基因,设计一对引物,通过扩增16SrRNA基因的PCR序列进行鉴定。此法特异性强、灵敏性高,可用于临床上检测猪附红细胞体病,并有特异性和检出率高的优点。

5 结语

(1)附红细胞体病由于常是隐性带菌感染,症状并不明显,一旦发生不但给养殖户造成巨大经济损失,而且给肉制品业带来极大的安全隐患。预防本病的发生应加强猪场的卫生防疫,消除各种应激因素,在易患病季节应定期喷洒杀虫剂,以杀灭蚊、蝇、跳蚤等吸血昆虫,消除传染媒介

(2)发病猪只要进行及时有效的治疗。对无治疗价值的病猪应及时进行淘汰,以清除传染源,阳性猪群,饲料中可添加四环素等,就以消除隐性感染。期待广大同仁今后不断加大对该病的诊断、发病机理、检测方法等方面的研究,共同造福于畜牧养殖业。