火针治疗对大鼠跟腱末端病HSP70表达的影响

史清钊　郭佳佳　张玉芹　方小芳

摘要：通过比较1次与4次火针治疗后大鼠跟腱末端区HSP70表达变化，探讨火针治疗末端病的作用机理，为末端病的火针治疗提供理论依据。采用“电击跳跃法”建立大鼠跟腱末端病模型，并对模型进行火针治疗。采用ABC法检测HSP70表达，在40倍物镜下进行阳性细胞计数。结果表明：治疗1组纤维软骨区、腱骨关节面软骨的HSP70阳性率显著高于对照1组 （P<0.05）；治疗2组纤维软骨区、腱骨关节面软骨的HSP70阳性率显著高于对照2组（P<0.05）；治疗3组腱骨关节面软骨的HSP70阳性率显著高于对照3组（P<0.05）；治疗4组腱骨关节面软骨的HSP70阳性率显著高于对照4组（P<0.05）；治疗5组纤维软骨区、腱骨关节面软骨的HSP70阳性率非常显著高于对照5组（P<0.01）。得出结论：1）1次火针治疗诱导末端区合成大量HSP70，主要表现在纤维软骨区、腱骨关节面软骨2个部位，使末端区组织和细胞对坏死、损伤产生抵抗，同时促进坏死、损伤组织和细胞的修复，对末端病的恢复起到了一定的促进作用。2）4次火针治疗后这2个部位的阳性率明显高于1次火针治疗，4次火针治疗能更进一步促进末端病的恢复。

关键词： 火针；跟腱；末端病；HSP70

中图分类号： G 804.2文章编号：1009-783X（2012）04-0376-05文献标志码： A

末端病是指肌腱、韧带、关节囊纤维层在骨上附着部分发生劳损性变性而引起的疾患^[1]。其发病部位多在四肢关节部位。例如，网球肘（肱骨外上髁炎）、肩袖损伤、跳跃膝、跟痛症等。末端病属慢性软组织损伤，治疗困难，且随着竞技体育和全民健身运动的发展，其发病率也呈逐年上升趋势。火针具有行气活血、温通经络和缓解炎症的作用，对各种慢性软组织损伤有显著疗效。经临床验证，用火针治疗网球肘^[2-3]、肩周炎^[4]、跟痛症^[5]等成功的病例已经有很多，且随着施针次数的增加，恢复效果更明显，至4次时已经基本痊愈，但涉及到作用机制的报道却很少。

研究证实，HSP70是在高温应激下合成最为迅速、表达最为丰富的一种蛋白^[6]。在末端病中，HSP70的表达可以保护受损组织和加速修复^[7-9]。火针疗法是将针具在火上烧红至发白发亮后快速刺入病体内，此时针身温度可超过800 ℃，这种高温产生的热刺激，对于受损的末端区组织来说可作为一种应激原，可以诱导跟腱末端区发生热休克反应，使HSP70合成增加。本文通过检测火针治疗大鼠跟腱末端病后末端区的HSP70变化，探讨火针治疗末端病的作用机制，为末端病的火针治疗方法提供理论依据。

1材料与方法

1.1实验设备

1）自制电刺激造模装置（如图1所示）：长55 cm，宽40 cm，高75 cm，其顶部完全没有遮盖；四周为光滑的有机玻璃，其底部为纵向排列的有一定间隔的铜棒，分别固定于木架上。电路两端连接一个变压器（调控电压范围在0～220 V）和一个带有计数器、计时器及电路短路报警信号灯的数控装置。在造模装置底部通电，使2个铜棒之间有电压，当大鼠的足部同时踩在相邻的2个铜棒上时，通过大鼠足部的电流迫使其向上跳跃，双足跳离铜棒即为有效跳跃。这样使实验动物完全模拟运动员的动作和训练状态，使造模结果与人体末端病更为接近。

2）细火针：购于北京中医药研究所。火针全长7.8 cm，柄长3.7 cm，直径为0.40 mm。

1.2实验对象及分组

1月龄雄性SD大鼠88只，体重（110±10）g。购于北京维通利华实验动物中心，饲养于北京301医院动物实验中心，将大鼠随机分为2个大组：安静对照组8只和造模组80只。

1.3造模方法

大鼠造模训练是参照姚小卫、扈盛等所确定的“电击跳跃法”而进行的^[10-11]。正式实验开始前，先进行3 d适应性训练，每只每天20 min。正式实验时，将治疗组和对照组大鼠放在自制电刺激造模装置内，一次8只。每15 s通电1次，持续20 min，休息10 min，再持续20 min。每天训练1次，每周一至周六进行，周日休息，持续训练8周。通电电压逐步加大，直到大鼠出现有效跳跃为止，一般在50 V左右，个别情况下达到80～100 V。

1.4火针治疗

将造模组随机分为治疗1、2、3、4、5组与对照1、2、3、4、5组，每组8只。其中，1～4组为1次火针治疗组，5组为4次火针治疗组。将大鼠固定，暴露其后肢，用酒精灯火焰烧细火针至发白亮，然后用火针于大鼠跟腱痛点处点刺，深度约为3 mm，分别对1次火针治疗组，4次火针治疗（1次/3d）组进行施针，每次治疗只施针1次，每日治疗均在09：00—10：00期间进行。

1.5取材及组织切片制作

1次火针治疗组施针后于第1、2、3、4天分别处死治疗1、2、3、4组及其相应对照组，并在第1 d处死安静对照组取材。4次火针治疗组在完成第4次治疗3 d后进行取材。取大鼠单侧后足跟腱和完整的跟腱末端区组织。将取下的组织分别放入10%甲醛固定液中，置于4 ℃冰箱保存24 h。之后用脱钙液进行脱钙，每3 d更换一次脱钙液并摇匀，连续脱钙5周。脱钙完毕后将组织块用自来水冲洗3 h后，然后上行酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋。石蜡切片机切片，每个标本连续切片6～8张，切片厚度6 μm，用涂有多聚赖氨酸的载玻片附片，40 ℃烘烤2 h后室温保存备用。

1.6测试指标及方法

1.6.1HE染色

检测地点：中国科学院生态环境研究中心。常规HE染色。

1.6.2HSP70检测

检测地点：中国科学院生态环境研究中心。

采用ABC法进行HSP70的检测，以及阴性对照实验。HSP70检测试剂盒：购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.7图像采集及处理

1.7.1HE染色

HE染色后用Olympus BX-51显微镜在10倍和20倍物镜下分别观察跟腱末端区跟腱（T）、纤维软骨区（UF）、钙化软骨区（MF）、跟骨（C）、腱骨关节面软骨（CA）、腱围组织（PT）的组织和细胞形态结构变化。

1.7.2HSP70检测

光镜下观察细胞浆及细胞核中呈现出棕黄色颗粒的部位即为表达处。每个标本选取一张切片，观察末端区跟腱（T）、纤维软骨区（UF）、钙化软骨区（MF）、跟骨（C）、腱骨关节面软骨（CA）共5个区域。最后在Olympus BX-51显微镜上观察，每个区域观察5个视野（不重复，不重叠），并在40倍物镜下拍照，对每个视野进行阳性细胞计数，并计算HSP70阳性率（HSP70阳性率=5个视野内阳性细胞数之和/5个视野内细胞总数）。

1.8统计分析

所有数据用SPSS 13.0处理，数据结果用平均值±标准差（X±S）表示，经单因素方差分析进行组间差异比较。当方差齐性时，用LSD post-hoc检验；当方差不齐时，用Tamhane post-hoc检验。P<0.05代表显著性差异，P<0.01代表非常显著性差异。

2结果

2.1HE染色结果

安静对照组大鼠跟腱主要由平行的腱纤维组成，呈波浪状弯曲排列。在纤维束之间，有成行排列呈梭型的腱细胞，体积较小，中央有椭圆形的细胞核，细胞核大，占整个细胞的大部分，纤维软骨区内Sharpey氏纤维相互交织成束。在Sharpey氏纤维之间，可见大量的软骨陷窝，每个陷窝内有1～2个呈椭圆形的软骨细胞紧挨在一起；潮线曲线平滑，其弯曲弧度与跟骨的轮廓基本一致；钙化软骨区与跟骨之间无明显分界，染色均匀，细胞数目较少；跟骨骨小梁呈片状，骨髓腔内有大量脂肪组织空泡；腱骨关节面轮廓清晰，边缘光滑；腱围内血管丰富，纤维轮廓明显，排列不规则，细胞数目较多^[12]。

造模组大鼠末端区均出现明显的末端病病理变化，与文献报道一致^[12]。1）跟腱：对照组腱纤维出现排列紊乱，甚至断裂，波浪状弯曲消失，并发现多处呈红染的玻璃样变性区；2）纤维软骨区：此区明显增厚，远侧端出现明显钙化，潮线呈现“火焰”状向纤维软骨区涨潮；3）钙化软骨区和跟骨，染色不均匀，细胞数量不多，体积比纤维软骨区的细胞大，细胞质丰富，基质中有时可见沉积岩样的层状排列；4）腱骨关节面软骨：软骨层明显增厚，关节面轮廓模糊不规则，偶见炎性细胞浸润；5）腱围：水肿、增厚，血管轻度扩张，偶见炎性细胞浸润。

2.2HSP70表达统计结果

安静对照组大鼠跟腱末端区各部位未见明显的HSP70表达，阳性个数、阳性率、平均灰度均为0。

与安静对照组相比，造模组大鼠末端区在跟腱、纤维软骨区、腱骨关节面软骨3个部位的HSP70阳性率有非常显著升高（P<0.01）。部分大鼠钙化软骨区、跟骨也出现少量阳性细胞，但与安静对照组相比没有显著性差异（P>0.05）。

与对照组相比，治疗组大鼠末端区主要在纤维软骨区、腱骨关节面软骨2个部位的HSP70阳性率有不同程度升高（如图2、3、4、5所示）。其中：治疗1、2组在纤维软骨区、腱骨关节面软骨的HSP70阳性率明显高于对照1、2组，呈显著性差异（P<0.05）；治疗3、4组仅在腱骨关节面软骨的HSP70阳性率明显高于对照3、4组，呈显著性差异（P<0.05）；治疗5组在纤维软骨区、腱骨关节面软骨2个部位的HSP70阳性率明显高于对照5组，呈非常显著性差异（P<0.01）。而在跟腱、钙化软骨区、跟骨的HSP70阳性率比对照组虽有所升高，但均无显著性意义（P>0.05），见表2、3。