遗传性小耳畸形家系FGF3基因启动子甲基化检测及意义

刘嘉锋,孙家明,李小丹

[摘要]目的：探讨遗传性小耳畸形家系FGF3基因启动子区域甲基化状态及意义。方法：应用甲基化特异性PCR（MSP）法检测遗传性小耳畸形患者及其直系亲属的FGF3基因启动子甲基化32例，同时以20例健康者为对照。结果：遗传性小耳畸形患者及直系亲属FGF3基因启动子甲基化状态明显低于对照组，且有显著性差异（P<0.01）。遗传性小耳畸形家系组中，患病者的基因甲基化程度小于耳廓正常者（P<0.05）.结论：FGF3基因启动子的甲基化状态可能与遗传性小耳畸形的发生有关。

[关键词]先天性小耳畸形家族；FGF3基因；甲基化

[中图分类号]R764.7[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）04-0611-02

Study of methylation of promoter of FGF3 gene in genetic microtia pedigree

LIU Jia-feng,SUN Jia-ming,LI Xiao-dan

(The department of plastic and reconstruction, Union hospital ,Tongji medical college, Huazhong science &technique university,Wuhan 430022,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the methylation in promoter of FGF3 gene in genetic microfia pedigree.MethodsThe methylation in FGF3 gene in 32 people of genetic microtia pedigree and 20 healthy controls were measured using Methylation-specific PCR(MSP).ResultsThe methylation of FGF3 gene in microtia were significantly lower than those in control(P<0.01).In the genetic microtia pedigree,the methylation of FGF3 gene in the patients were significantly lower than those in the healthy people(P<0.05).ConclusionsHypomethylation of FGF3 gene may related to the pathogenesis of genetic microtia．

Key words:Genetic mierotia pedigree;FGF3 gene;Methylation

小耳畸形是常见的先天性疾病，对其基因学的研究虽有一定的定位，然而，目前仍未明确某个基因的改变必然引起小耳畸形的发生。FGF3是脊椎动物头部软骨形成的关键调节因子，FGF3及FGFR2基因的突变可能导致在胚胎时期软骨细胞分化及迁移的障碍，有学者发现一家系FGF3基因上存在三个纯合子突变，并认为该突变与内耳发育不良及小耳畸形有密切相关[1]，而FGF3基因启动子甲基化状体及其在遗传性小耳畸形发生中的作用至今仍未见报道，本文拟通过对遗传性小耳畸形家系的研究，了解家系成员中FGF3基因启动子甲基化状态及其在小耳畸形发生中的作用。

1资料和方法

1.1 研究对象：选取2007年7月～2011年7月在华中科技大学同济医学院附属协和医院整形外科就诊的遗传性小耳畸形家系4个，选其健在的直系亲属32人进行研究，其中男性19人，女性13人，年龄5～57岁。选择同期就诊的耳廓正常、无其他先天性畸形家族史的患者20例为对照。

1.2 实验方法

1.2.1标本采集及DNA提取：抽取两组病例空腹静脉血6ml,4℃保存备用，血标本收集完成后，提取血样中的DNA，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检。质检合格的DNA将浓度调整后，置-20℃储存备用。

1.2.2 亚硫酸氢钠处理基因组DNA：参照甲基化特异性PCR方法，用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，用2.5倍体积预冷无水乙醇和2μl糖原沉淀DNA，-40℃ 过夜；然后用70%乙醇洗涤沉淀2次，干燥后用30μl去离子水溶解，-4O℃ 保存。

1.2.3 甲基化特异性PCR：设计FGF3基因甲基化引物正义链和反义链，非甲基化引物的正义链及反义链。总体积为30μl反应液中含DNA 5μl，10×缓冲液3μl，MgCl22.5mmol/L，引物0.5μmol/L，dNTP250μmol/L，Hotstar Taq 0.5μl。MSP反应条件：95℃,15min，95℃, 30 S，60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃ 延伸10min。

1.3 统计学方法：采用SPSS11.5软件统计数据，血浆FGF基因甲基化分析采用χ2检验，P≤O.05为差异有统计学意义。

2结果

实验组血浆FGF3基因甲基化程度明显小于对照组（P<0.01）,实验组中，患病者的基因甲基化程度小于耳廓正常者（P<0.05）。

3讨论

3.1 先天性小耳畸形是常见的先天性疾病，其发病率较高，约1/7 000[2],它主要因为胚胎时期第一鳃沟及其邻近的第1、2鳃弓的发育异常引起的一组颌面畸形，主要表现为外耳及中耳的异常，传导性或混合性耳聋，有时伴有耳前凹陷或副耳[3-4]。其病因尚不明确，环境和遗传是重要发病因素，遗传因素虽不是小耳畸形的主要致病因素，但目前家族遗传性小耳畸形的报道并不鲜见[5-6]，基因改变在小耳畸形发生中的作用受到学者们的广泛重视。

3.2 传统的基因突变是指存在DNA序列改变的可遗传的基因表达的改变，但是近年来发现以DNA甲基化、组蛋白修饰[7]及染色质重塑等为主的没有DNA序列变化的改变，可产生可以遗传的基因表达改变，统称为表观遗传学改变。DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化，在DNA序列不变的情况下，控制基因的表达，调节DNA重组及某些特定基因组区域的转录活性。DNA的甲基化状态改变作为一个表观的标签，易于受激素、饮食以及药物等外界因素的可逆的修饰，标示出该基因是沉默或表达。当甲基化程度越高，基因就越“沉默”，反之亦然。在肿瘤疾病中DNA甲基化改变表现为整个基因组低甲基化、局部基因高甲基化[8]。潘博等[9]前期研究未发现小耳畸形患者中存在EYA1基因突变位点，林琳[10]等对该基因启动子的甲基化状态进行研究，结果发现存部分区域的低甲基化，并推测可能与小耳畸形的发病有关。

3.3 FGF3是脊椎动物头部软骨形成的关键调节因子[11]；而在胚胎肢体发育中，成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）在由干细胞向软骨细胞分化中发挥重要的作用。Hellingman等[12]认为FGFR2在人间充质干细胞向软骨诱导分化的第一期，即间质凝集期有明显的表达，表明FGF3及其受体信号途径在软骨发生过程中起重要的作用。FGF3及FGFR2基因的突变，可能导致在胚胎时期软骨细胞分化及迁移的障碍。有学者发现FGF3上存在的三个纯合子突变（p.S156P，p.R104X，及p.V206SfsX117）与以内耳发育不全、小耳及小牙症为表征的综合征性耳聋有密切相关[1]；目前虽尚未见小耳畸形患者中存在FGF3基因甲基化改变的相关报道，对于其基因甲基化状态的研究将进一步解释FGF3基因与小耳畸形发生的关系。

3.4 笔者的研究发现在FGF3基因启动子上存在低甲基化状态，提示可能与小耳畸形的发生有关，其机制可能是因为FGF3基因具有基因剂量效应，即剂量达到一定阈值基因才能发挥正常功能，所以同一家系不同成员中存在外显不全或表观度变异。此外，基因低甲基化也可能引起患侧组织染色体重构，并进而导致细胞表型的变化。进一步的研究将详细了解哪些具体位点的甲基化改变，以及FGF3整体的低甲基化改变对基因表达及耳软骨细胞发生及迁移的影响。

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[收稿日期]2011-12-15 [修回日期]2012-02-19

编辑/张惠娟