普萘洛尔对血管瘤内皮细胞的抑制作用

杨永勤,孙沫逸,李建虎,梁亮,申志远

[摘要]目的：探讨不同浓度普萘洛尔在不同时间段内对血管瘤内皮细胞的抑制作用。方法：收集手术切除的新鲜婴幼儿血管瘤标本，采用组织块法培养内皮细胞，免疫荧光法对培养的细胞进行鉴定；通过绘制生长曲线和流式细胞仪检测普萘洛尔(propranolol) 对血管瘤内皮细胞增殖影响。结果：伴随普诺洛尔浓度增大(0μg/ml，20μg/ml，40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，120μg/ml)及作用时间的增加（24h,48h,72h）对血管瘤内皮细胞的抑制作用明显增强；流式细胞仪测定不同浓度普萘洛尔作用不同时段后 血管瘤内皮细胞凋亡明显。结论：普萘洛尔能抑制血管瘤内皮细胞的增殖并促进其凋亡，抑制血管瘤的生长。

[关键词]普萘洛尔；血管瘤内皮细胞；凋亡

[中图分类号]R732.2[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2012）04-0602-03

Effects of propranolol on proliferation of hemangioma endothelial cells from infantile

YANG Yong-qin,SUN Mo-yi,LI Jian-hu,LIANG Liang,SHEN Zhi-yuan

(Department of Oral and Maxillofacial Surgery,School of Stomatology,The Fourth Militiary Medical University,Xi＇an 710032,Shanxi,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the Effects of propranolol on proliferation of hemangioma endothelial cells from infantile.MethodsIn this study,we treated the vascular endothelial cells of hemangioma in 96-well plates with different dose(0μg/ml to 120μg/ml)of propranolol.the survival and proliferatoin of the vascular endothelial cells of hemangioma were evaluated by the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetra-zoloum(MTT) assay and crystal violet assay. The effects of propranolol on the vascular endothelial cells of hemangioma were observed by cell growth curves and flow cytometry.ResultsWith the augmentation of the concentration of propranolol (0μg/ml,20μg/ml, 40μg/ml, 60μg/ml,80μg/ml,100μg/ml, 120μg/ml)and the lengthening of action time（24h,48h,72h）,proliferation of hemangioma endothelial cells are inhibiting apparently.AnnexinV-PI assay were aslo performed.propranolol could inhibit the growth of vascular endothelial cells of hemangioma and advancing apoptosis. Conclusion Propranolol is able to inhibit the proliferation of the hemangioma endothelial cells , and to advance apoptosis of vascular endothelial cells,resulting in inhibition of hemangioma.

Key words:Propranolol; hemangioma endothelial cells；apoptosis

针对血管瘤，目前临床常用的药物主要有糖皮质激素、干扰素α、环磷酰胺、长春新碱等，然而，这些药物均有其不同程度的不良反应，因此在临床使用中受到不同程度的限制。自2008年，法国Bordeaux儿童医院Léauté-Labrèze等医生在美国《新英格兰医学杂志》报道了他们应用普萘洛尔（propranolol）治疗婴儿血管瘤的重大发现。报道用β受体阻断剂-普萘洛尔（propranolol）成功治疗小儿血管瘤患者后，因普萘洛尔耐受性良好，相比类固醇有较少的副作用，或将成为药物治疗血管瘤的新选择。本实验采用组织块法培养出血管瘤内皮细胞，并将不同浓度普萘洛尔添加到传代后的血管瘤内皮细胞培养基中进行培养。探讨普萘洛尔是否对血管瘤内皮细胞有抑制作用，进而证明其对血管瘤是否有治疗作用。

1材料和方法

1.1 标本来源：第四军医大学口腔医院手术切除的血管瘤标本。

1.2 主要试剂和仪器：DMEM/F-12培养基培养基（Hyclone）、胰蛋白酶（Amresco）、青霉素+链霉素、胎牛血清(胎牛血清)，D'hanks（武汉谷歌生物），鼠抗人Ⅷ因子、MTT （北京索莱宝）、DMSO（北京索莱宝）、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒（凯基生物），96孔培养板（Corning）、CO2恒温培养箱（SANYO）、FAC-SCalibur型流式细胞仪(Becton Dickinson公司)、计算机数据处理软件(BD公司Cellquest软件)。

1.3 血管瘤内皮细胞分离和培养：①标本， 4℃无菌D～Hank液试管中保存；②用D-Hank液及PBS液冲洗标本至肉眼观察冲洗液颜色清亮，无浑浊及脱落组织；③去除多余的皮肤及脂肪，选择瘤体组织，适当修剪成1～2cm3的组织块， 0.25%胰蛋白酶中37℃振荡消化10～20 min，加入含1O%胎牛血清(fetalbovine serum，FBS)培养液中止消化；④将消化后的组织微粒，接种于事备好的培养皿内，静置10 min；然后加入约0.5ml完全内皮细胞培养基(成分DMEM/F-12培养基培养基、20% 胎牛血清、1O IU L青霉素、100 mg／I 链霉素)，仅使培养液刚刚湿润组织块，勿使组织块浮起，置于培养箱内孵育；⑤24 h后补充培养基，使培养液缓慢浸润组织块，置培养箱继续培养；5 天后更换培养液；⑥接种后1周去除组织块，倒置相差显微镜下确认内皮细胞岛，用细胞刮去除非内皮细胞，更换培养液后继续培养，每3天更换培养液1次；⑦细胞汇合成片铺满培养皿时按1∶3比例传代培养。

1.4 血管瘤内皮细胞形态学观察、鉴定

1.4.1 形态学观察：倒置相差显微镜下观察血管瘤内皮细胞生长情况和形态学特征，并用数码照相机记录观察的结果（图1）。

1.4.2 免疫荧光法鉴定：将血管瘤内皮细胞进行细胞爬片， PBS冲洗2遍，4%多聚甲醛室温下固定30 min，PBS冲洗，0.3%的过氧化氢室温下封闭10 min，然后用正常血清室温下封闭10 min，分别加入第Ⅷ 因子相关抗原鼠抗人抗体(工作浓度l∶200) 4℃过夜，PBS冲洗后在暗室条件下加入鼠抗兔二抗荧光显色液，荧光显微镜下观察拍照（图2）。

1.5 MTT对血管瘤内皮细胞毒性的测定

1.5.1 MTT检测细胞抑制率：①将对数生长期细胞用胰蛋白酶消化后配制成浓度为1～10×104个/ml的细胞悬液，经过细胞技术按10000细胞/孔接种于96孔板，每孔加200μl；②将平板置37℃、5%CO2湿度培养箱中24h后，于24h、48h、72h分别加入各个细胞样品对应的含有一定浓度药物（0μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,60μg/ml,80μg/ml,100μg/ml, 120μg/ml）的培养基，每个样本浓度设平行的三个孔，对照组加不含样本的培养液200μl，再放入培养箱中孵育；③于倒置显微镜下拍照，拍摄200×的细胞状态；④每孔加入用按5mg/ml新鲜配制的MTT溶液50μl，温育4h，使MTT还原为甲瓒，当在倒置显微镜下看到孔板内的细胞周围出现丝状紫色结晶体时倒掉上清液，每孔加DMSO（二甲基亚砜）200μl，用平板摇床摇匀后，使用酶标仪测定光密度值（OD）（检测波长570nm），以溶剂对照处理细胞为对照组，按公式计算普萘洛尔对细胞的抑制率。

1.5.2 改良寇式法计算IC50：

改良寇式法:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大剂量，I:lg(最大剂量/相临剂量)，P:阳性反应率之和，Pm:最大阳性反应率，Pn:最小阳性反应率

1.6 流式细胞仪检测细胞周期及凋亡：①接种细胞至六孔板，吸除培养液，用PBS或其它适当溶液洗涤细胞一次，加入1ml胰酶消化细胞，待细胞变圆，部分细胞悬浮，即加入PBS终止消化；②用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮.离心1 500转5min，弃上清；③加入3ml PBS，用漩涡震荡仪是细胞充分悬浮于PBS中，离心1 500转5min，弃上清；④加入300μl的裂解缓冲液（Binding Buffer）悬浮细胞；⑤Annexin V-FITC，Propidium Iodide （PI）使用前瞬时离心集液；⑥加入5μl Annexin V-FITC混匀后，加入5μl Propidium Iodide，混匀；⑦室温、避光、反应5～15min.8.在1 hour内，进行流式细胞仪的检测.用流式细胞仪检测，激发波长Ex=488 nm；发射波长Em=530 nm。Annexin V-FITC的绿色荧光通过FITC通道（FL1）检测；PI红色荧光通过PI通道（FL2）检测。

1.7 统计结果χ2检验：不同浓度(0μg/ml,20μg/ml, 40μg/ml,60μg/ml,80μg/ml,100μg/ml,120μg/ml)作用后血管内皮细胞作用不同时间（24h,48h,72h）后抑制率。统计学处理：应用spss17.0统计软件包对细胞增殖抑制率进行分析。采用总体方差分法,P<0.05,差异显著,有统计学意义,可以认为随普萘洛尔浓度的增大及作用时间的延长，普萘洛尔对血管瘤内皮细胞的抑制作用明显增强。

2结果

2.1 组织块结合酶消化法培养初学管理血管内皮细胞并对细胞进行纯化（如图1），扩增及采用免疫荧光法检测（如图2）。

2.2 MTT法检测培养于含有不同浓度（0μg/ml,20μg/ml, 40μg/ml，60μg/ml，80μg/ml，100μg/ml，120μg/ml）普萘洛尔培养基中作用不同时间（24h、48h、72h）后血管瘤内皮细胞的存活率。经实验数据分析，血管瘤内皮细胞伴随普奈落浓度的增大及作用时间的延长，血管内皮细胞的抑制作用明显增强（如图3）。

2.3改良寇氏法测定普萘洛尔作用血管瘤血管内皮细胞后的IC50为100μg/ml。

2.4流式细胞仪检测不同浓度普萘洛尔作用血管瘤内皮细胞后的细胞凋亡情况，结果显示普萘洛尔可明显促进血管瘤内皮细胞的凋亡（如图4a、b、c）。

3讨论

3.1 普萘洛尔抑制血管瘤内皮细胞增殖的作用及其意义：2008年在Bordeaux儿童病院Léauté-Labrèze等医生用普萘洛尔治疗一位伴有严重的鼻部血管瘤的阻塞性、肥厚性心肌病的患儿时发现，患者面部的血管瘤逐渐减小，停用后仍然减小，最后血管瘤几近完全消失[1]。随后众多医生开始尝试在临床使用普萘洛尔治疗血管瘤，试图将其作为一种新的治疗血管瘤的药物。根据文献报道单独使用普萘洛尔治疗血管瘤得到一定的疗效，并未发现明显的并发症[2-3]，但是，没有说明其对血管瘤的明确作用机制，同时也没有一个统一给药剂量标准，处于临床尝试阶段。血管内皮细胞现已被公认为血管瘤增殖期占主要细胞成分。本实验取手术切除的血管瘤组织采用组织块法培养血管瘤内皮细胞并对其进行鉴定[4]，并将不同浓度普萘洛尔添加于血管瘤内皮细胞培养基中进行培养，探讨普萘洛尔对血管瘤内皮细胞的增值影响，并试图筛选出普萘洛尔作用于血管瘤内皮细胞的最适浓度，为该药的临床应用提供了实验依据。

3.2 血管瘤是婴幼儿期常见的肿瘤，40%～60%发生于头颈部。近年来，许多作者对血管瘤的病变过程进行了相关研究，同时对实施了具体治疗的病例和只进行了保守观察的病例之间预后的差别行了比较，并制定了一定的治疗方案。体积较小、病变处于稳定期、消退期和消退完成期的血管瘤适于随访观察，增生期血管瘤需按照循序渐进的原则进行积极治疗。手术治疗不再作为早期血管瘤的首选，而是用于血管瘤后期残存病变的切除或修整。有些作者主张使KTP、Nd：YAG激光治疗等方法，更多主张使用闪光灯脉冲染料激光，但是组织内激光照射治疗会产生瘢痕，并且会对深部解剖结构产生损害，所以使用前应考虑到其安全性.综合先前各种治疗方法[5-9]，都有其明显的缺点，目前临床对表浅的血管瘤主张局部药物注射治疗，创伤小，不会产生明显的瘢痕，本实验旨在探索普萘洛尔对血管瘤内皮细胞的抑制作用并通过将血管内皮细胞培养于含有不同浓度普萘洛尔的培养基中，通过对其作用不同时间段进行检测，统计分析表明其对血管瘤内皮细胞有明显抑制作用，并通过改良寇氏公式计算出普萘洛尔作用血管内皮细胞的IC50为100μg/ml，这为临床用药治疗血管瘤提供了更准确的治疗依据，为该药的临床应用提供了实验依据。也为临床采用普萘洛尔治疗血管瘤提供了更准确的依据，同时增加了药物治疗血管瘤的选择。本实验采用流式细胞仪检测到普萘洛尔可以促进血管瘤内皮细胞的凋亡。这表明普萘洛尔可通过凋亡途径抑制血管瘤内皮细胞的增殖，可能为普萘洛尔治疗血管瘤的机制之一。

[参考文献]

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[收稿日期]2011-12-22[修回日期]2012-02-28

编辑/张惠娟