复合酶法提取金针菇多糖及光谱分析

梁敏 邹东恢 郭宏文 李昂

摘要：研究了复合酶法提取金针菇（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）多糖的最佳工艺条件，并对金针菇多糖进行了光谱分析。采用木瓜蛋白酶、纤维素酶复合处理，对加酶质量比、酶解温度、ｐＨ、酶解时间4个因素对多糖提取率的影响进行了正交试验。确定了复合酶法提取金针菇多糖的最佳工艺条件为酶解温度６０ ℃，复合酶添加量０．５％，加酶质量比（木瓜蛋白酶∶纤维素酶）２∶１，ｐＨ ６．０，酶解时间２ ｈ，此条件下多糖提取率可达９．１％。

关键词：金针菇（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）多糖；复合酶法提取；正交试验；光谱分析

中图分类号：Ｓ６４６．１＋５；ＴＳ２０１．１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）06－1210-04

Combined-Enzyme Extraction and Spectral Analysis of Flammulina velutipes Polysaccharides

LIANG Mina,ZOU Dong-huib,GUO Hong-wenb, LI Angb

（ａ． Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ； ｂ． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｂｉｏ－Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｑｉｑｉｈａｒ Uｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｑｉｑｉｈａｒ １６１００６， Ｈｅｉｌｏｎｇｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｗｅｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ ｂｙ ｃｏｍｂｉｎｅｄ－ｅｎｚｙｍｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｓｐｅｃｔｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ． Ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｄｏｓｅ ｏｆ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ ａｎｄ ｐａｐａｉｎ， ｐＨ， ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｗere ａｎａｌｙｚｅｄ ｂｙ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ test． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ６０ ℃； Mａｓｓ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｅｎｚｙｍｅ， ０.５％； Aｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｐａｐａｉｎ ｔｏ ｃｅｌｌｕｌａｓｅ， ２∶１； ｐＨ， ６．０； Rｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ， ２ ｈ． Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ ｗａｓ ｕｐ ｔｏ ９．１％ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅｓｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ； ｃｏｍｂｉｎｅｄ－ｅｎｚｙｍｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ； ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ； ｓｐｅｃｔｒａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ

金针菇（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ ｖｅｌｕｔｉｐｅｓ）又名冬菇、朴菇、构菌、青杠菌、毛柄金钱菌，隶属担子菌亚门（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ）层菌纲（Ｈｙｍｅｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）伞菌目（Ａｇａｒｉｃａｌｅｓ）口蘑科（Ｔｒｉｃｈｏｌｏｍａｔａｃｅａｅ）金钱菌属（Ｆｌａｍｍｕｌｉｎａ）。金针菇菌盖滑嫩、菌柄细长脆嫩、形美、味鲜，是世界上著名的食药两用菌和观赏菌［１］，具有较高的营养价值和药用价值，有广阔的开发前景。

金针菇子实体中除含有蛋白质、氨基酸、矿物质、维生素和对人体有益的微量元素外还含有一种重要的生物活性高分子多糖，金针菇多糖由于具有抑制肿瘤、抗癌、增强肌体免疫力［２－４］等作用而受到广泛重视。如何提高金针菇多糖的提取率、降低成本已成为拓展金针菇使用范围、提高其应用价值的关键。

传统的浸提法虽然是提取多糖的经典方法，但时间长、效率低、能耗大；金针菇多糖通常被包裹在植物细胞壁内，并且多糖往往和蛋白质结合在一起，以蛋白质多糖的形式存在。研究表明中性蛋白酶能有效酶解与多糖结合在一起的蛋白质，从而将多糖释放出来而提高多糖提取率，同时降低了多糖中蛋白质的含量，提高了多糖的纯度［５］。复合酶法处理可以提高多糖提取率、减少能源消耗、缩短提取时间。因此，探索更为高效、经济、可靠的提取方法对金针菇多糖的研究开发具有重要的现实意义。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１原料取市售新鲜金针菇，除去根部，清洗切块，粉碎，干燥，过４０、６０、８０、１００目筛，过筛之后把各级金针菇干粉分别装到清洁干燥的烧杯中，置于真空干燥箱中待用。

1.1.2试剂苯酚，天津市科密欧化学试剂开发中心；葡萄糖，天津市凯通化学试剂有限公司；Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５色谱柱，Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司；纤维素酶，国药集团化学试剂有限公司；木瓜蛋白酶，北京世纪时尚科贸有限公司。所用试剂均为分析纯。

１．１．3仪器与设备电热恒温水浴锅：上海跃进医疗器械厂；电子天平：北京赛多利斯仪器系统有限公司；７２２型紫外分光光度计：北京赛多利斯仪器系统有限公司；离心机：上海跃进医疗器械厂；九阳料理机：山东九阳小家电有限公司；ＴＨＺ－８２Ａ型台式恒温振荡器：上海跃进医疗器械厂；Ｌａｍｂｄａ－３５紫外可见分光光度计：美国ＰＥ公司；Ｓｐｅｃｔｕｍ ｏｎｅ傅里叶变换红外光谱仪：美国ＰＥ公司。

１．２方法

１．２．1葡萄糖标准曲线的制定以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标作图。得葡萄糖标准曲线的回归方程为■＝０．００７ ３ｘ＋０．０１４ ６，ｒ＝０．９９６ ６，在０～５０ μｇ／ｍＬ范围内呈良好的线性关系。

１．２．2多糖清液的提取方法称取８０～１００目的金针菇干粉５ ｇ，放入２５０ ｍＬ的三角瓶中，加入一定量去离子水，混合均匀后置于５０ ℃水浴锅中水浴３０ ｍｉｎ，调节ｐＨ，称取木瓜蛋白酶和纤维素酶按一定比例混合，加入５ ｍＬ去离子水溶解，金针菇溶液放在水浴中预热至酶解温度，将酶液加入到金针菇溶液中，在恒温振荡器上提取，反应结束，将三角瓶放到沸水鍋中，沸水浴１０ ｍｉｎ灭酶，灭酶结束冷却至室温，将酶提取液放入到离心管中，５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心，取上清液，即得到复合酶法提取的多糖清液。

１．２．3蛋白质的去除方法采用Ｓｅｖａｇ法去除多糖清液中的蛋白质［6］。在多糖清液中加入其１／４体积的氯仿－正丁醇（氯仿与正丁醇体积比４∶１），将其置于具塞试管中，充分摇匀３０ ｍｉｎ后用离心机离心１０ ｍｉｎ，剔去下面的白色浑浊液，取上清液，这样的操作重复进行３～４次即可除去蛋白质。

１．２．4多糖的获得方法金针菇多糖在水中的溶解度较大，所以先用去离子水初步提取，之后取上清液，用２0 g/L的活性炭脱色１ ｈ，加入体积分数为９５％的乙醇，使溶液中乙醇的体积分数达到７５％进行醇沉，醇沉过程中要将其保存在４ ℃冰箱中，保持２４ ｈ后５ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，取沉淀，置于真空干燥箱中干燥，即可得到金针菇多糖［7］。

１．２．5多糖含量的测定方法采用苯酚－硫酸比色法［8］，苯酚－硫酸法是以硫酸、苯酚作为显色剂，它们与金针菇多糖发生显色反应后在４９０ ｎｍ波长处测定其吸光度，再通过已经获得的葡萄糖标准曲线计算求得金针菇中的多糖含量。

１．２．６单因素试验

１）物料粒度对金针菇多糖提取率的影响。将金针菇粉通过４０、６０、８０、１００目筛，分别得到小于４０目、４０～６０目、６０～８０目、８０～１００目和１００目以上的金针菇粉，取一定量的以上５种样品，选择料水质量比１∶１５，５０ ℃水浴中提取１ ｈ，计算各样品的多糖提取率，研究物料粒度对金针菇多糖提取率的影响。

２）料水质量比对金针菇多糖提取率的影响。等量称取８０～１００目的金针菇粉５份，选择料水质量比１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０，分别于５０℃水浴中提出１ｈ，计算各样品的多糖提取率，研究料水质量比对金针菇多糖提取率的影响。

３）复合酶添加量对金针菇多糖提取率的影响。等量称取８０～１００目的金针菇粉４份，选择料水质量比１∶２０，加入适量复合酶［加酶质量比（木瓜蛋白酶∶纤维素酶）＝１∶１），控制复合酶质量分别为金针菇粉质量的０．３％、０．４％、０．５％、０．６％，在５０℃水浴中提取１ ｈ，计算各样品的多糖提取率，研究复合酶添加量对金针菇多糖提取率的影响。

1.2.7正交试验影响金针菇多糖的提取因素很多，通过预试验选择其中的4个因素作为研究的对象：加酶质量比（木瓜蛋白酶∶纤维素酶）、酶解温度、pH、酶解时间。采用四因素三水平正交试验确定提取金针菇多糖的最佳条件，因素与水平见表1。

１．２．8多糖的色谱分离纯化方法金针菇多糖粗品水溶解后，取１０ ｍＬ上Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ－７５色谱柱。用恒流泵控制流速（２０ ｍＬ／ｈ），自动部分收集器收集，每管收集２．０ ｍＬ，用苯酚－硫酸法测定各洗脱液于４９０ ｎｍ处的吸光度，收集其流出液，冷冻干燥得到纯化后的样品。

1.2.9多糖成分分析方法

1）红外吸收光谱分析。采用美国ＰＥ公司的Ｓｐｅｃｔｕｍ ｏｎｅ傅里叶变换红外光谱仪，在４００~４ ０００ cｍ-1范围内对提取的金针菇多糖进行红外吸收光谱扫描。

2）紫外吸收光谱分析。采用美国ＰＥ公司的Ｌａｍｂｄａ－３５紫外可见光分光光度计，在１９０～800 ｎｍ范围内对提取的金针菇多糖进行紫外吸收光谱扫描。

２结果与分析

２．１单因素试验结果

２．１．１物料粒度对金针菇多糖提取率的影响从图1可知，小于４０目、４０～６０目、６０～８０目、８０～１００目和１００目以上的金针菇粉的多糖提取率分别为２．７%、２．９%、３．１%、３．４%和３．３%，由此可知８０～１００目的金针菇粉多糖提取率最高（图１）。因此试验选定物料粒度为８０～１００目。

２．１．２料水质量比对金针菇多糖提取率的影响从图2可知，料水质量比为１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０的条件下金针菇的多糖提取率分别为２．３%、３．１%、３．４%、３．５%和３．５%，当料水质量比在１∶１５和1∶10之间，随着料水质量比的减小，多糖提取率较快地增长，继续减小料水质量比多糖提取率仍有升高，但升高速率减小。在提取中加水太少、太多皆不利于以后的分离，而且加重了生产中的负担。因此试验确定料水质量比为１∶２０。

２．１．３复合酶添加量对金针菇多糖提取率的影响从图３可以看出，随着复合酶添加量的增加，多糖提取率也逐渐增加，复合酶添加量大于０．５％后多糖提取率增加趋于平缓，考虑到酶的成本及效果，复合酶添加量宜为０．５％。

２．２金针菇多糖提取的正交试验结果分析

由表2中４个因素的极差值可知，影响金针菇多糖提取率的4个因素的主次顺序是Ａ＞Ｄ＞Ｃ＞Ｂ。通过正交试验可知复合酶法提取金针菇多糖的最佳工艺条件为Ａ３Ｂ２Ｃ２Ｄ２，即加酶质量比（木瓜蛋白酶∶纤维素酶）为２∶１，酶解温度为６０ ℃，ｐＨ ６．０，酶解时间为２ ｈ，此时金针菇的多糖提取率为９．１％。

２．3金针菇的多糖成分分析结果

２．3．１金针菇多糖结构红外吸收光谱分析结果红外吸收光谱是有机化合物结构表征的重要方法，在实验室得到了普遍的应用。有机化合物的化学键或官能团都有各自的特征振动频率，因此可以测定化合物的红外吸收光谱，根据吸收带的位置，推断出分子中可能存在的化学键或官能团，再结合其他信息便可确定化合物的结构［９，１０］。由图4可知，３ ４７５和３ ４１６ ｃｍ－１处峰值是由多糖中Ｏ－Ｈ的伸缩振动引起的，羟基在分子间发生缔合，并不是游离的；在２ ９０７ ｃｍ－１处是由多糖中Ｃ－Ｈ的伸缩振动引起的；在１ ６３７～１ ６１８ ｃｍ－１处吸收峰是－ＣＨＯ的Ｃ＝Ｏ的伸缩振动引起的，为肽链上酰胺碳基的吸收峰；在１ ５６４ ｃｍ－１处是由多糖中Ｃ－Ｈ的变角振动引起的；在１ ４７２ ｃｍ－１处是由多糖中Ｃ－Ｏ－Ｃ和Ｃ－Ｏ－Ｈ的伸缩振动引起的；在８４９ ｃｍ－１处是由β－吡喃环中Ｃ－Ｈ的变角振动引起的；在８２０ ｃｍ－１处为α－吡喃环中Ｃ１－Ｈ的变角振动吸收峰；在８０５ ｃｍ－１处是由吡喃环中Ｃ１－Ｈ的变角振动引起的。金针菇多糖具有典型的多糖物质的吸收峰，而且多糖中存在吡喃环和呋喃环，具有α、β构型。

２．3．２金针菇多糖结构紫外吸收光谱分析结果紫外吸收光谱应用广泛，可用于有机化合物的结构表征以及有机化合物的定量分析。由于此法灵敏度较高，能检测出１０－５～１０－４ ｍｏｌ／Ｌ浓度的化合物，因此在试验中可采用此法测定其中的微量杂质如核酸和蛋白质［１１，１２］。由图5可知，得到的紫外吸收光谱较为光滑，在核酸（吸收峰２６０ ｎｍ）和蛋白质（吸收峰２８０ nｍ）吸收波长处未出现峰值，所以核酸和蛋白质的含量较小。

３结论与讨论

采用正交试验确定了金针菇多糖复合酶法提取的最佳工艺条件，即木瓜蛋白酶与纤维素酶质量比为２∶１，复合酶添加量为0.5%，酶解温度为６０ ℃，ｐＨ为６．０，酶解时间为２ ｈ，此时多糖提取率为９．１％。

参考文献：

［１］ 姜思昌，孙云汉．金针菇的保健功能［Ｊ］．食品研究与开发，２００３， ２４（４）：８８－９０．

［２］ ＫＩＨＯ Ｔ，ＭＯＲＩＭＯＴＯ Ｈ，ＫＯＢＡＹＡＳＨＩ Ｔ，ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ（ＴＡＰ） ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｆｒｕｉｔｉｎｇ ｂｏｄｉｅｓ ｏｆ Ｔｒｅｍｅｌｌａ ａｕｒａｎｉｔｉａｏｎｇｌｕｃｏｓｅｍｅｔａｂｏｌｉｓｍｉｎ ｍｏｕｓｅ ｌｉｖｅｒ［Ｊ］． Ｂｉｏｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，２０００，６４（２）：４１７－４１９．

［３］ 吳梧桐，高美凤，吴文俊． 多糖的抗肿瘤作用研究进展［Ｊ］． 中国天然药物，２００３，１（３）：１８２－１８６．

［４］ ＫＩＨＯ Ｔ，ＵＳＨＩ Ｓ，ＵＫＡＩ Ｓ，ｅｔ ａｌ． Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｆｅａｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ａ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ （ＣＳ－Ｆ１０） ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｍｙｃｅｌｉｕｍ ｏｆ Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ［Ｊ］． Ｂｉｏｌ Ｐｈａｒｍ Ｂｕｌｌ，１９９９，２２（９）：９６６－９７０．

［５］ 王雪冰，赵天瑞，樊建． 食用菌多糖提取技术研究概况［Ｊ］．中国食用菌，２０１０，２９（２）：３－６．

［6］ 叶凯贞，黎碧娜，王奎兰． 多糖的提取、分离与纯化［Ｊ］．广州食品工业科技，２００４（３）：１４４－１４５．

［7］ 李世敏，刘冬． 金针菇多糖提取新工艺的优化［Ｊ］． 食品与发酵工业，２００２，２８（１０）：４５－４８．

［8］ 董群，郑丽伊，方积年． 改良的苯酚－硫酸法测定多糖和寡糖含量的研究［Ｊ］． 中国药学杂志，１９９６，３１（９）：５５０－５５２．

［９］ 郭亚贞，王慥，曲鹏鹏． 香菇多糖的纯化和结构分析［Ｊ］． 上海水产大学学报，２０００，９（１）：３５－３９．

［１０］ 张正行． 有机光谱分析［Ｍ］． 北京：人民卫生出版社，１９９５．

［１１］ ＴＯＭＡＴＩ Ｕ，ＢＥＬＡＲＤＩＮＥＬＬＩ Ｍ，ＧＡＬＬＩ Ｅ，ｅｔ ａｌ． ＮＭＲ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｉｃ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ ｅｄｏｄｅｓ ｇｒｏｗｎｏｎｏｌｉｖｅｍｉｌｌ ｗａｓｔｅ［Ｊ］. Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３３９（６）：１１２９－１１３４．

［１２］ 叶姜瑜，谈锋． 紫芝多糖的纯化及组分分析［Ｊ］． 西南师范大学学报（自然科学版），２００２，２７（６）：９４５－９４９．