转录因子基因Mfhb-1的表达对苜蓿体细胞胚胎发生过程中营养元素含量的影响

周岩 何男男 魏琦超 张胜利 薛晓锋 赵俊杰

摘要：Ｍｆｈｂ－１基因是在苜蓿体细胞胚胎发生诱导早期经扣除杂交得到的ＨＤ－Ｚｉｐ Ⅰ类转录因子基因，相关研究表明，Ｍｆｈｂ－１基因在苜蓿体细胞胚胎发生诱导的早期可能发挥重要作用。为了进一步探讨Ｍｆｈｂ－１基因的生物学功能与营养元素吸收的关系，试验以经２，４－Ｄ诱导的苜蓿幼嫩叶片的叶肉细胞为材料，利用电感耦合等离子体发射光谱技术，对Ｍｆｈｂ－１基因的正义、反义转化植株体细胞胚胎发生发育过程中的１０种营养元素含量进行了测定。结果显示，Ｍｆｈｂ－１基因的表达可能在苜蓿体细胞胚胎发生诱导初期促进了对Ｎａ元素的吸收，同时抑制了对Ｍｇ、Ｚｎ元素的吸收；Ｃｕ、Ｋ、Ｆｅ、Ｍｎ等元素的含量变化可能受Ｍｆｈｂ－１基因表达的影响较小。不过Ｍｆｈｂ－１基因表达与营养元素吸收的关系，以及进而如何影响苜蓿体细胞胚胎发生的详细分子作用机理等有待于进一步研究。

关键词：苜蓿；Ｍｆｈｂ－１基因；ＨＤ－Ｚｉｐ转录因子；体细胞胚胎；营养元素；电感耦合等离子体发射光谱技术

中图分类号：Ｓ５４１＋．１；Ｑ７８６；Ｑ８１３．７ 文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）06－1165-06

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｇｅｎｅ Ｍｆｈｂ－１ ｏｎ ｔｈｅ Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ

ＺＨＯＵ Ｙａｎ１，ＨＥ Ｎａｎ－ｎａｎ１，２，ＷＥＩ Ｑｉ－ｃｈａｏ１，ＺＨＡＮＧ Ｓｈｅｎｇ－ｌｉ１，ＸＵＥ Ｘｉａｏ－ｆｅｎｇ１，ＺＨＡＯ Ｊｕｎ－ｊｉｅ１

（１． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｅｎａｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｘｉｎｘｉａｎｇ ４５３００３， Ｈｅｎａｎ， Ｃｈｉｎａ；

２． Ｈｏｎｇｑｉ Ｆａｒｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｉｘｔｈ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ， Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｃｒｏｐｓ， Ｃｈａｎｇｊｉ ８３１７０２，Ｘｉｎｊｉａｎｇ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｎａｍｅｄ Ｍｆｈｂ－１ ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ Ｌ． ｂｙ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｃＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｂｅｌｏｎｇｅｄ ｔｏ ａ ｋｉｎｄ ｏｆ ＨＤ－Ｚｉｐ Ｉ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ｇｅｎｅ． Ｒｅｌｅｖａｎｔ ｓｔｕｄｉｅｓ ｈａｄ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ｃｌｏｓｅｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｔｏ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍ． ｆａｌｃａｔａ． Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ， ｙｏｕｎｇ ｌｅａｆ ｃｅｌｌ ｆｒｏｍ ｓｅｎｓｅ ａｎｄ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｉｎｄｕｃｔｅｄ ｂｙ ２，４－Ｄ ｔｏ ｐｒｏｃｅｓｓ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ， １０ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｕｒｖｅｙｅｄ ｂｙ ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ＩＣＰ－ＡＥＳ） ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ｍｏｓｔ ｌｉｋｅｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｎａ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｗｈｉｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｍｇ， Ｚｎ ｅｌｅｍｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ Ｍ． ｆａｌｃａｔａ； Aｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ， ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｆｈｂ－１ ｈａｄ ｎｏｔ ｓｈｏｗｅｄ ａｎ ｏｂｖｉｏｕｓ ｉｍｐａｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈａｎｇｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｃｕ， Ｋ， Ｆｅ ａｎｄ Ｍｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｔｏ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｓｏ ｔｈａｔ ｔｏ ｔａｋｅ ａ ｓｔｅｐ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｒｅｖｅａｌ ｔｈｅ ｉｎｓｉｇｈｔ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｔａｉｌｅｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ Ｌ．； Ｍｆｈｂ－１ ｇｅｎｅ； ＨＤ－Ｚｉｐ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ； ｓｏｍａｔｉｃ ｅｍｂｒｙｏ； ｎｕｔｒｉｅｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔ； ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ

苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ ｆａｌｃａｔａ Ｌ．）是研究植物体细胞胚胎发生的典型模式植物之一，Ｍｆｈｂ－１基因是在苜蓿体细胞胚胎发生诱导早期，经扣除杂交得到的 同源异型域——亮氨酸拉链蛋白（Hemeodomain leuzine zipper，HD-Zip）Ⅰ类转录因子基因。为了研究该基因的生物学功能，在前期利用正义、反义转化技术将该基因导入到了苜蓿中，并已得到该基因过量表达和低量表达的转化植株［１，２］。

转录因子对各种功能基因的调控作用可能受到光照、植物激素、低溫等逆境条件的影响。营养元素是植物体内一系列生理生化反应的关键辅助因子，因而在参与调控植物早期生长发育及其植物形态构建的过程中发挥着重要作用。前期研究结果显示，基因的表达可能与苜蓿体细胞胚胎发生过程密切相关［１］，但具体的分子机理尚不清楚。本研究利用电感耦合等离子体发射光谱（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ ｃｏｕｐｌｅｄ ｐｌａｓｍａ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ＩＣＰ－ＡＥＳ）法检测Ｍｆｈｂ－１基因正义、反义转化植株体细胞胚胎发生过程中的１０种营养元素含量，以探讨Ｍｆｈｂ－１的过量表达或低量表达对苜蓿体细胞胚胎发生过程中营养元素的吸收产生的影响，从而确定在苜蓿体细胞胚胎发生过程中该基因表达与营养元素含量变化的关系，进而为全面揭示Ｍｆｈｂ－１基因作用的分子机理提供相关的研究方法和理论依据。

１材料与方法

１．１植物材料

试验所用的苜蓿材料共有４ 种，分别是４７／１－５、Ｄ３、Ｆ４、Ｃ５；其中４７／１－５为苜蓿未转化的材料，作为试验的对照；Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５是以 ４７／１－５为起始材料经转化得到的转化体，Ｄ３为携带Ｍｆｈｂ－１基因编码区反向序列的反义转化植株；Ｆ４为携带Ｍｆｈｂ－１ 基因编码区序列的正义转化植株；Ｃ５为携带全长 Ｍｆｈｂ－１基因，包括编码区以及该编码区上游的保守序列开放阅读框（upstream open reading frames，uORF）序列的正义转化植株。４ 种苜蓿材料均在ＭＳ固体培养基、２２ ℃、光照时间１６ ｈ／ｄ的条件下进行试验材料的扩大培养。

参照Ｄｅｎｃｈｅｖ等建立的的苜蓿直接体细胞胚胎发生体系［３］，取培养８～１２ ｄ的植株，剪下靠近顶端的叶片约 １２片，在含有少许 Ｂ５Ｏ培养基的培养皿里切成小块，然后吸出液体，把切碎的叶片转入含有４０ ｍＬ Ｂ５Ⅳ（２，４－Ｄ ４．０ ｍｇ／ｍＬ）培养基的１００ ｍＬ三角瓶里，进行液体悬浮振荡培养，直接诱导其体细胞胚胎发生，诱导时间为１８ ｄ。然后转入Ｂ５／３ Ｍ培养基中，使前期叶肉细胞悬浮培养物继续发育，每 １０ ｄ 更换培养基一次，共发育培养３０ ｄ。培养条件为温度 ２２ ℃、光照时间１６～1８ ｈ／ｄ、转速为１２０ ｒ／ｍｉｎ。在苜蓿体细胞胚胎发生诱导培养的开始、第五天、第十天、第十五天、第十八天和发育培养的第十天、第二十天、第三十天分别取材，并称取１ ｇ培养物，３次重复，经液氮速冻后放入超低温冰箱（－８０ ℃）中保存，待用。

将材料从超低温冰箱中取出后放入烘箱中，１０５ ℃杀青３ ｈ，８０ ℃烘干至恒重，转移至瓷坩埚中，用马弗炉２００ ℃ 炭化１ ｈ、４００ ℃灰化３ ｈ，至灰化完全（无黑色颗粒）后取出冷却，加 ３ ｍＬ ＨＣｌ－ＨＣｌＯ４（４∶１，体积比）混合液混匀，在电阻板上加热至完全溶解，定容至１０ ｍＬ。

１．２Ｍｆｈｂ－１基因结构

Ｍｆｈｂ－１基因正义与反义结构如图１所示，在图１中，Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ２为携带Ｍｆｈｂ－１基因编码区上游的开放阅读框（ｕＯＲＦ）序列；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ３为Ｍｆｈｂ－１基因反义编码区，Ｄ３ 植株携带该片段；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ４为Ｍｆｈｂ－１基因正义编码区（ＣＤＳ），Ｆ４植株携带该片段；Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ ５为Ｍｆｈｂ－１基因全长序列（开放阅读框＋编码区序列），Ｃ５植株携带该片段。

１．３主要试剂与设备

ＨＣｌ、ＨＣｌＯ４、ＨＮＯ３均为分析纯，由天津德恩化学试剂有限公司生产；试验用水均为超纯水，由德国ＳＧ公司Ｕｌｔｒａ Ｃｌｅａｒ ＵＶ Ｐｌｕｓ超纯水机现制现用。

使用Ｏｐｔｉｍａ ２１００ ＤＶ电感耦合等离子体原子发射光谱仪（美国ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ公司），垂直观测，观察位置自动优化；双阵列背投式固态ＣＣＤ检测器光学系统、ＲＹＴＯＮ材料雾化器、内置式三通道蠕动泵、４０．６８ ＭＨｚ 自激式固态高频发生器、空气切割消除尾焰技术系统、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ循环水冷却系统等均为实验室原已具备的仪器。

营养元素标准溶液储备液为Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｅ、Ｃｏ 混合标准液，浓度均为１ ０００ μｇ／ｍＬ（德国默克公司）。将标准储备液用体积分数为２％ 的 ＨＮＯ３逐级稀释，Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｅ、Ｃｏ等混合标准液按０．００、０．５０、１．００、２．００、４．００、８．００ μｇ／ｍＬ梯度进行配制。

１．４ＩＣＰ－ＡＥＳ工作参数

用ＩＣＰ－ＡＥＳ检测样品溶解液中Ｃｕ、Ｆｅ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎａ、Ｋ、Ｃａ、Ｍｇ、Ｓｅ、Ｃｏ的离子浓度，ＩＣＰ－ＡＥＳ仪器工作参数分别是工作功率１．３ ｋＷ、辅助气体流量０．２ Ｌ／ｍｉｎ、冷却气体流量１５．０ Ｌ／ｍｉｎ、载气０．８ Ｌ／ｍｉｎ、进样泵流量１．５ Ｌ／ｍｉｎ，

２结果与分析

２．１分析波长的选择及背景的校正

ＩＣＰ－ＡＥＳ法对每种营养元素的测定都可以同时选择多条特征谱线，且具有同步背景校正功能。因此，试验过程中对每种检测营养元素同时选取２～３条谱线进行测定，综合分析强度、干扰情况及稳定性，选择谱线干扰少、精密度高的分析线。各营养元素的分析波长选择结果分别是Ｃｕ ３２４．７５ ｎｍ、Ｆｅ ２５９．９３ ｎｍ、Ｚｎ ２１３．８５ ｎｍ、Ｍｎ ２５７．６１ ｎｍ、Ｎａ ５８９．５９ ｎｍ、Ｋ ７６６．４９ ｎｍ、Ｃａ ３１７．９３ ｎｍ、Ｍｇ ２７９．０７ ｎｍ、Ｓｅ １９６．０２ ｎｍ、Ｃｏ ２２８．８５ ｎｍ。

２．２回归方程和相关系数

按选择的工作条件检测各营养元素在配制好的系列梯度浓度的标准品混合溶液下的峰面积，用峰面积（ｙ）对标准液浓度（ｘ，μｇ／ｍＬ）绘制标准工作曲线。各营养元素的线性方程和相关系数见表１。

２．３样品测定结果

经ＩＣＰ－ＡＥＳ检测，４种苜蓿材料中Ｃｏ元素和Ｓｅ元素含量的测定结果为负值，低于系统检出限；其他８种营养元素的测定结果见图２，其中图２Ａ为Ｃａ元素的含量动态变化，图２Ｂ为Ｍｇ元素的含量动态变化，图２Ｃ为Ｎａ元素的含量动态变化，图２Ｄ为Ｚｎ元素的含量动态变化，图２Ｅ为Ｃｕ元素的含量动态变化，图２Ｆ为Ｋ元素的含量动态变化，图２Ｇ为Ｆｅ元素的含量动态变化，图２Ｈ为Ｍｎ元素的含量动态变化。

由４种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中各营养元素含量动态变化可以看出，Ｃａ元素在４种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中均表现出先下降后上升再下降并保持平稳的变化趋势，在诱导培养阶段的第五天，４种苜蓿材料的Ｃａ元素含量由高到低表现为Ｆ４、４７／１－５、Ｃ５、Ｄ３；在诱导培养后期（１８ ｄ），Ｃ５和Ｆ４的Ｃａ元素含量上升，Ｄ３和４７／１－５的Ｃａ元素含量保持平稳的态势。

Ｍｇ元素含量在４种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的动态变化较为复杂。在体胚诱导培养阶段内，除４７／１－５表现出先下降后上升的趋势外，Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５均表现出先上升后下降的变化，而Ｄ３的峰值在诱导培养阶段的第十天出现，早于Ｃ５的第十五天，也早于F4的发育培养阶段第十天。Ｍｇ元素含量在发育培养阶段的初期（发育培养１０ ｄ）还有一个高峰出现，此时４种苜蓿材料的Ｍｇ元素含量由高到低分别为Ｆ４、Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３。

Ｎａ元素含量在４种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化波動较为复杂，Ｆ４和４７／１－５大致表现为在诱导培养阶段的第五天有一个高峰，然后下降，最后在发育培养阶段的末期有一个小幅上升；Ｃ５的Ｎａ元素含量在诱导培养阶段峰值出现前有一个下降的过程，诱导培养的第五天开始迅速上升，诱导培养的第十天达峰值后开始下降，在发育培养阶段表现出与Ｆ４和４７／１－５类似的变化趋势；Ｄ３的Ｎａ元素含量在诱导培养阶段一直增加，在发育培养阶段开始后才表现出下降趋势。

Ｚｎ元素含量在４种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化十分明显，除了Ｄ３的峰值出现在诱导培养阶段的第十天外，其他３种材料的峰值均出现在诱导培养阶段的第十五天，４种材料在诱导培养阶段的Ｚｎ元素含量峰值由高到低分别为Ｄ３、Ｃ５、４７／１－５、Ｆ４。而在发育培养阶段开始后，4种苜蓿材料的Ｚｎ元素含量基本上一直处于很低的水平，并且保持平稳。

Ｃｕ元素含量在４种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化跌宕起伏，Ｆ４、Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３都表现为在诱导培养阶段先下降后上升再下降的变化趋势；进入发育培养阶段后，都是先上升后下降；以４７／１－５材料的Ｃｕ元素含量最高，峰值出现在诱导培养阶段的第十五天；其次是Ｃ５材料，Ｃｕ元素含量峰值出现在诱导培养阶段的第十天；第三是Ｄ３材料，Ｃｕ元素含量峰值出现在发育培养阶段的第十天；而Ｆ４材料的Ｃｕ元素含量峰值出现在诱导培养阶段的第十五天。到发育培养阶段结束前１０ ｄ（发育培养２０ ｄ），４种材料的Ｃｕ元素含量都处在最低值，并且一直维持到发育培养阶段结束。

Ｋ元素含量在４种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中基本上处于下降的趋势，４种材料的Ｋ元素含量峰值大都没有超过诱导培养阶段的起始水平；到发育培养阶段结束时（发育培养３０ ｄ），４种苜蓿材料的Ｋ元素含量由高到低分别为４７／１－５、Ｆ４、Ｃ５、Ｄ３。

Ｆｅ元素含量在苜蓿４种材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化起伏很大，在发育培养阶段结束前１０ ｄ（发育培养２０ ｄ），与Ｃｕ元素含量的变化趋势基本一致，4种材料的Fe元素含量大都处在最低值；但在发育培养２０ ｄ后，４种材料的Ｆｅ元素含量出现了戏剧性的变化，其含量水平大幅上升，最后都超过了前面水平，达到了峰值，此时４种苜蓿材料的Ｆｅ元素含量由高到低分别为Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３、Ｆ４。

Ｍｎ元素含量在４种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的变化趋势和Ｚｎ元素正好相反，其在诱导培养阶段基本上都处在较平稳的状态，而一进入发育培养阶段，４种材料的Ｍｎ元素含量立即大幅度上升，峰值出现在发育培养阶段的第十天，而后迅速下降，到发育培养阶段结束时，又恢复到诱导培养阶段的水平。４种材料的Ｍｎ元素含量达峰值时由高到低的排序为Ｆ４、Ｄ３、４７／１－５、Ｃ５。

３讨论

３．１Ｍｆｈｂ－１基因的表达对苜蓿体细胞胚胎发生发育的影响

苜蓿４种材料体细胞胚胎发生发育的显微观察［４，５］显示，在诱导培养阶段的第十天，Ｆ４和４７／１－５的表面会形成一些突起结构；在第十五天时，Ｄ３和Ｃ５表面才出现微小的突起结构。在发育培养阶段，Ｄ３和Ｃ５的表面白色组织增多，且培养液浑浊不清，在发育培养的第三十天时，观察到Ｆ４培养物中出现一些小的子叶胚，而其他３种材料多是鱼雷胚。在发育培养的第二十八天时，统计４种材料的体细胞胚胎数目，由高到低依次为Ｆ４、４７／１－５、Ｃ５、Ｄ３。上述结果表明，Ｍｆｈｂ－１基因编码区的表达可能促进了苜蓿体细胞胚胎胚性细胞的诱导，从而促进了苜蓿体细胞胚胎的发生，而ｕＯＲＦ的表达可能对该基因的表达有一定的抑制作用。

３．２Ｍｆｈｂ－１基因的表达对苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中营养元素含量的影响

Ｍｆｈｂ－１基因的表达可能促进了苜蓿对Ｃａ元素的吸收。由图２Ａ可以看出，在苜蓿体细胞胚胎发生发育进行诱导培养的第五天，４种材料的Ｃａ元素含量由高到低依次为Ｆ４、４７／１－５、Ｃ５、Ｄ３，这与苜蓿体细胞胚胎发生发育情况和最后（发育培养的第二十八天［4，5］）体细胞胚胎数量所观察到的排序结果相吻合。在诱导培养后期，Ｆ４和Ｃ５的Ｃａ元素含量上升，Ｄ３和４７／１－５的Ｃａ元素含量保持平衡，说明Ｃａ元素对胚性细胞的形成可能有一定的促进作用，由此可推测Ｍｆｈｂ－１基因的表达可能促进了苜蓿体细胞胚胎诱导后期阶段对Ｃａ元素的吸收。

Ｍｆｈｂ－１基因的表达可能促进了苜蓿对Ｍｇ元素的吸收。图２Ｂ表明，Ｍｇ元素含量在苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中的变化较为复杂。除４７／１－５表现出先下降后上升的趋势外，Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５均表现出先上升后下降的趋势，而Ｄ３的峰值在诱导培养阶段的第十天出现，早于Ｃ５的第十五天，也早于F4的发育培养阶段第十天。在发育培养的初期，４种材料的Ｍｇ元素含量由高到低表现为Ｆ４、Ｃ５、４７／１－５、Ｄ３，并且与最后所观察到的体细胞胚胎数目排序情况类似［４］；由此可推测Ｍｆｈｂ－１ 基因的表达可能促进了苜蓿对Ｍｇ元素的吸收。

Ｍｆｈｂ－１基因的表达可能促进了苜蓿对Ｎａ元素的吸收。图２Ｃ揭示，Ｎａ元素含量在苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中变化波动较为复杂，在诱导培养阶段的第五天，除了Ｃ５的Ｎａ元素含量呈下降趋势外，其他３种材料的Ｎａ元素含量均呈上升趋势，其中Ｆ４上升的最迅速；该现象可能是由于ｕＯＲＦ的表达而导致Ｃ５的Ｎａ元素含量峰值较Ｆ４与４７／１－５ 滞后。结合体细胞胚胎发生发育观察结果［４］，可以推测Ｍｆｈｂ－１基因的过量表达可能在苜蓿体细胞胚胎发生诱导的初期，就促进了苜蓿对Ｎａ元素的吸收。

Ｍｆｈｂ－１基因的表达可能抑制了苜蓿对Ｚｎ元素的吸收。由图２Ｄ可以观察到，Ｚｎ元素含量在苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中的变化十分明显，除了Ｄ３的峰值出现在诱导培养阶段的第十天外，其他３种材料的峰值均出现在诱导培养阶段的第十五天，且４种材料在诱导培养阶段Ｚｎ元素含量峰值由高到低表现为Ｄ３、Ｃ５、４７／１－５、Ｆ４，与最后的体细胞胚胎数目统计结果呈反比关系。由此表明，高含量的Ｚｎ元素可能不利于苜蓿胚性细胞的分化，由此可推测Ｍｆｈｂ－１基因的表达在苜蓿体细胞胚胎发育培养阶段初期就可能抑制了对Ｚｎ元素的吸收。

在４７／１－５、Ｄ３、Ｆ４和Ｃ５这４种材料中，Ｃｕ元素、Ｋ元素、Ｆｅ元素、Ｍｎ元素含量在苜蓿体细胞胚胎诱导和发育过程中的变化大体趋于一致，表明 Ｍｆｈｂ－１基因的过量或低量表达，对Ｃｕ、Ｋ、Ｆｅ、Ｍｎ元素的含量变化影响不明显。

３．３主要营养元素对体细胞胚胎发生发育的影响

目前对营养元素在体细胞胚胎发生发育中的具体生物學功能的研究较少，主要集中在与体细胞胚胎发育模式相似的合子胚上。如许淑苹［６］在研究杉木［Cunninghamia lanceolata（Lamb.）Hook］合子胚的发育时发现，Ｃｕ元素的含量在合子胚发育进程中呈小幅上升变化；Ｐ元素含量总体上呈较大幅度上升；Ｋ、Ｍｎ、Ｃａ元素含量呈先下降后上升的变化；Ｍｇ元素含量在体胚发育的后期呈持续上升趋势，而后达到最高值；Ｃｏ和Ｎｉ元素含量较低，Ｃｏ元素的含量不超过 １ μｇ／ｇ，Ｎｉ元素的含量不超过３ μｇ／ｇ。甄艳等［７］在研究湿地松（Pinus elliottii Engelmann）×加勒比松（P. caribaea Morelet）的杂种合子胚发育过程中，发现Ｍｎ、Ｎｉ、Ｂ、Ｎａ、Ａｌ和Ｋ元素在胚胎发育早期的合子胚中含量最高；Ｐ、Ｍｇ和Ｆｅ元素呈相似的变化趋势，在发育开始后先小幅下降而后随胚发育逐渐上升；Ｃａ元素在合子胚发育早期的含量较高，随后下降，而后大幅度上升，在合子胚发育后期达到最大值。本研究发现，对照材料４７／１－５的体胚发育培养１０ ｄ后，Ｋ、Ｎａ元素含量随着胚胎的发育不断升高；Ｚｎ元素含量总体变化不大；Ｃａ、Ｃｕ、Ｆｅ元素含量峰值均出现在体细胞胚胎诱导或发育的中间阶段，Mg元素含量峰值出现在体胚诱导末期；Mn元素含量峰值出现在体胚发育初期。

已有研究发现，高浓度的钠离子可以使蛋白变性，也可以影响细胞质中蛋白质的功能［８］。液泡缺少钠离子将会削弱酶的功能，也会限制生长发育。拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）ａｔｒａｂ２８基因在胚胎形成后期表达，它编码的核内靶蛋白可以增加胚胎形成后期的阳离子容量，当该蛋白在拟南芥中过量表达时还可以促进拟南芥萌芽的发生［８］。钙离子对于调节植物渗透压扮演着重要的角色，不同的植物细胞对钙离子存在不同的响应，一般情况下，钙离子在细胞信号传导过程中起到中心作用［９］，如在组织培养中，钙离子的浓度变化体系中含有大量胚胎表达的钙离子依赖蛋白激酶［１０］。铁是植物生长发育所必需的元素，主要作为结构螯合物或金属蛋白存在于植物组织中，常参与氧化还原反应，然而铁的不溶性限制了它的吸收；通过细胞质膜三磷酸腺苷酶的细胞外酸化，可以帮助将铁泵进细胞内，铁被膜还原酶还原成二价铁离子，然后转运进细胞内［１１］。黄立皓［１２］研究发现，Ｃｕ、Ｆｅ和Ｍｇ离子含量的增加可以提高愈伤组织中细胞的渗透势，促进细胞中遗传物质的形成，从而提高愈伤组织分化率。Ｐｒｉｙａｎｋａ等［１３］在研究卵叶车前（Ｐｌａｎｔａｇｏ ｏｖａｔａ Ｆｏｒｓｓｋ）体胚与非胚性愈伤组织中营养元素含量时发现，高含量的Ｋ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｃｕ和Ｚｎ是体胚形成的关键因素。本研究发现，在对照材料４７／１－５体细胞胚胎的发育过程中（转入发育培养基１０ ｄ之后），体细胞胚胎发育培养物中的Ｋ、Ｎａ元素含量不断上升，表明Ｋ、Ｎａ元素在苜蓿体胚的发育成熟过程中可能起重要的作用。

綜上所述，Ｍｆｈｂ－１基因的表达与苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中多种营养元素含量的变化有着密切的关系。该基因的表达可能在体细胞胚胎发生发育过程的不同阶段，通过促进植物体细胞胚胎诱导材料对营养元素的吸收（如在体细胞胚胎诱导前期促进Ｎａ元素的吸收），同时抑制对另一些营养元素的吸收（如在体细胞胚胎诱导前期对Ｍｇ、Ｚｎ元素的吸收），或者通过影响这些营养元素含量的变化趋势或模式，从而参与调节体细胞胚胎发生进程中各类基因群的表达，以及一系列相应的生理生化反应，进而达到调控苜蓿体细胞胚胎发生发育过程的作用。但营养元素含量与Ｍｆｈｂ－１基因表达在苜蓿体细胞胚胎发生发育过程中的相互关系，以及详细的分子作用机理还有待进一步探讨。

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