西瓜甜瓜蔓枯病病菌差异性初步研究

胡凤云　莫贱友　韦继光　郭堂勋　黄穗萍　潘朝勃

摘 要： 初步研究了西、甜瓜蔓枯病病菌差异性，为深入了解西、甜瓜蔓枯病病原提供理论依据。采用离体叶片接种法对19个西、甜瓜蔓枯病菌株进行致病力差异性研究，并对不同菌株核糖体基因内转录区序列（rDNA-ITS）比较分析。结果发现：不同西、甜瓜蔓枯病菌株致病力存在显著性差异，病情指数为85.11～4.58；但不同菌株间的ITS序列比较差别不大，保守程度高，菌株间的分化和变异不明显。

关键词： 西瓜； 甜瓜； 蔓枯病； 病菌差异性

西、甜瓜蔓枯病（Didymella bryoniae）是一种真菌性土传病害，危害植株茎基部和节间部。由于受保护地特殊生态环境条件以及广西地区常年高温高湿气候的影响，近年来广西西瓜和甜瓜病害发生种类日益增多，数量越来越大，危害程度越来越严重，严重影响了西、甜瓜的产量和品质，给瓜农造成了很大的经济损失。其中，蔓枯病就是西、甜瓜的重要病害之一。据笔者近几年的调查，在南宁市郊区各西、甜瓜种植基地蔓枯病危害也有加重的趋势，武鸣县武帽农场保护地种植瓜类每年种植二、三茬，由于同类作物不断连作，造成菌源大量积累，同一大棚内春季蔓枯病发病率为20%～30%，秋季发病率在80%～100%，损失在 40% 以上。因此深入研究西、甜瓜蔓枯病病菌差异性，对西、甜瓜蔓枯病防治具有十分重要的现实意义。

1995年Amand等[1]研究了8个蔓枯病菌株对不同葫芦科作物的致病力，结果显示基本无差异。2008年吴海波等[2]研究了来自江苏和海南的4个蔓枯病菌株的致病力，结果显示差异不显著。江蛟[3]比较了4个蔓枯病菌株的ITS序列，结果发现菌株之间遗传多样性不明显。本研究即利用离体叶片接种法对西、甜瓜蔓枯病菌株进行致病力差异性研究，并对19个西、甜瓜蔓枯病菌株的ITS序列进行比较分析，以期了解西、甜瓜蔓枯病病菌差异性，不同菌株之间是否存在分化和变异，为深入研究西、甜瓜蔓枯病病原提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

病原菌来源：采自广西壮族自治区南宁市郊西、甜瓜各种植区及柳州、北海、桂林等地具有典型蔓枯病症状的西瓜和甜瓜病株样本，经分离、纯化获得。

1.2 试验方法

1.2.1 不同菌株对同一西瓜品种致病力差异研究

在张永兵等[4]的方法基础上稍做改进。试验于2011年9-11月在广西农业科学院植物保护研究所科研基地及真菌研究室进行。将西瓜种子（西农8号）消毒、播种，出苗后长至3～5片真叶时，取其第3～5 片展开的幼叶，用灭菌蒸馏水冲洗干净后，晾干叶片表面水分，用软毛笔将配制好的孢子悬浮溶液（5×105个·mL-1）接种至叶片上，然后将其置于灭过菌铺有湿滤纸的培养皿中，另设内含不接种病菌只接灭菌蒸馏水叶片的培养皿为对照；在 25 ℃ 条件下进行培养，光照周期为16 h光照/ 8 h 黑暗，相对湿度约90 %。每个处理3片叶，重复3 次。

接种培养3～4 d后，按以下分级标准进行病情级数调查，并计算出病情指数。0级，叶片未发病；1级，叶片发病面积在10% 以下；3级，叶片发病面积 10%～25%；5级，叶片发病面积 26%～50%；7级，叶片发病面积 51%～75%；9级，叶片发病面积 76%～100%。

病情指数按以下公式计算：

1.2.2 不同菌株核糖体基因内转录区序列（rDNA-ITS）比较

1.2.2.1 蔓枯病菌菌丝的收集 将不同采样地点（南宁郊区以及柳州、桂林、北海等地）的19株蔓枯病菌接种于PSA培养基上培养4 d后，接入PD液体培养基中，振荡培养（25 ℃，80 r·min-1）4～7 d，用灭菌纱布过滤后，用无菌水冲洗2～3次，用滤纸吸干水分，冷冻干燥，低温保存备用。

1.2.2.2 蔓枯病菌总DNA的提取 采用SDS裂解法[5]，其中稍有改进，具体步骤如下：（1）将单孢分离培养菌株用灭菌移液枪头把菌丝体从培养基上轻轻刮下，然后挑到已灭菌的2 mL离心管中。（2）挑黄豆粒大小菌丝到一灭菌的2 mL离心管，每管加2颗用无水乙醇灼烧过的钢珠，加400 μL SDS（十二烷基硫酸钠）缓冲液；研磨打碎菌丝约20 min，12 000 r·min-1、4 ℃ 离心10 min，取上清液400 μL。（3）加200 μL饱和酚、200 μL氯仿，12 000 r·min-1、4 ℃ 离心15 min，取上清液。（4）加2 μL RNase，37 ℃ 恒温水浴1 h。（5）加200 μL饱和酚、200 μL氯仿，12 000 r·min-1、4 ℃ 离心15 min，取上清液约350 μL。（6）加上清液2倍体积的无水乙醇（预冷）、1/2体积的3 mL NaOAc（预冷，pH值5.2），轻翻转混匀，-20 ℃ 冻30 min。（7）12 000 r·min-1、4 ℃ 离心10 min，弃上清液（慢慢倒，小心DNA被倒出），简单离心，用移液枪吸走多余液体。（8）加100 μL 70% 酒精洗DNA 2～3遍，烘干。（9）加50 μL去离子水（65 ℃ 预热），混匀，-20 ℃ 保存。

1.2.2.3 核糖体基因内转录区序列的PCR扩增及测序 PCR扩增：以ITS1（5-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3）和ITS4（5-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3）为引物，扩增rDNA的ITS1、5.8S和ITS2区域。反应体系含DNA模板1 μL（约10 ng），10×缓冲液（20 mmol·L-1 Tris-HCl， 20 mmol·L-1 KCl） 2.5 μL，Mg2+（25 mmol·L-1 MgCl2） 2 μL，dNTP（共10 mmol·L-1，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mmol·L-1） 0.2 μL，引物（ 2 μmol·L-1）各1 μL，Taq酶0.2 μL，加ddH20至25 μL。扩增程序为：94 ℃ 预变性4 min，然后进入循环，94 ℃ 变性30 s，55 ℃ 退火1 min，72 ℃ 延伸90 s，共35个循环，最后72 ℃ 延伸10 min。

电泳检测：取PCR扩增产物5 μL，加入1 μL 6×loading buffer，混匀，点样于1.5% 的琼脂糖凝胶（含0.05 μL·mL-1 Goldview）上样孔中进行电泳检测（120 V，30 min）。PCR产物委托上海生工生物技术公司测序。

1.2.2.4 蔓枯病菌间rDNA-ITS序列比较 将测序结果放入GenBank数据库中进行Blast比对，搜索同源性序列。根据这些序列与数据库中已鉴定出的菌株的ITS序列相似度，从分子水平对收集的蔓枯病菌进行鉴定与比较。将测得的rDNA-ITS序列利用DNAssist version 2.2软件进行比较，分析菌株之间是否存在遗传多样性。

2 结果与分析

2.1 不同菌株对同一西瓜品种的致病力差异

调查发现：致病力强的菌株在西农8号离体叶片上接种1 d 后叶面就出现水渍状斑点，2 d 后发病率在 50% 以上，侵染处开始褐化，病斑呈不规则形状沿叶脉扩展。4 d 后发病率高达100 %，许多相邻病斑扩展连成一片，而对照叶面则未发病。这表明蔓枯病菌的分生孢子可以在离体叶片上正常萌发，并引起叶片发病。离体叶片接种4 d后，叶片出现不同程度感染，19个蔓枯病菌菌株之间病情指数存在显著性差异，表现出不同的致病力，且绝大多数蔓枯病菌株致病力居中或偏强。其中，WMMK-47、WMMK-10、WTMK-76、WTMK-23等菌株病情指数均较高，致病力较强。而LZMK-34、QXMK-69 病情指数较低，致病力弱（表1）。

2.2 不同蔓枯病菌菌株ITS序列比较分析

对来自不同地区的19个菌株，采用SDS裂解法提取病原菌的总DNA，以提取到的总DNA为模板，采用特异性引物分别扩增出了19个蔓枯病菌菌株的ITS序列。结果如图1所示，扩增片断大小在500 bp左右。通过PCR产物测序发现得到的19株蔓枯病菌的ITS序列长度在518～533 bp（图 1）。

通过Blast比对搜索发现，所测得的19条ITS序列与GenBank数据库中子囊菌门球壳菌属 （Didymella Sacc.）的瓜类黑腐球壳菌 Didymella bryoniae 相似度均在98% 以上。而Didymella bryoniae的无性型正是壳二孢属西瓜壳二孢菌Ascochyta citrullina。该结果进一步从分子角度明确了该菌的分类地位。

采用DNAsist version2.2软件对测得的19株蔓枯病菌的ITS序列进行比对，结果发现这19株真菌的ITS序列间差别不大，非常保守 （图2）。

3 讨 论

本研究采用离体叶片接种法对不同来源的19个菌株在同一西瓜品种（西农8号）上的致病力进行测定。结果发现不同菌株之间致病力有较大差异，分离获得的绝大多数蔓枯病菌株致病力居中或偏强。该结果与Amand等[1]和吴海波等[2]的实验结果有一定的差异，这可能是由于实验条件不同或选择的供试品种不同造成的，也有可能是因为存在不同的生理小种，值得进一步探讨。

研究表明，测定分析真菌rDNA-ITS序列是进行真菌分类鉴定以及系统发育研究的有效方法之一[6]。目前，真菌 rDNA-ITS序列比对分析已被广泛应用于许多病原真菌的系统发生上。本研究对19株来源不同的蔓枯病菌的ITS序列进行比对，结果发现这19株真菌的ITS序列间差别不大，非常保守，菌株间遗传多样性不明显。虽然其中15株菌株来自南宁市郊，但BHMK-59、LZMK-34、LZMK-34和GLMK-85分别采集自北海、柳州和桂林地区，采样地点相距较远，但地理位置之间的差异并未体现在菌株的遗传多样性上。因此认为，广西地区西、甜瓜蔓枯病菌群分化和变异不明显，整体上比较单一。

不同蔓枯病菌菌株的致病力存在差异，而又为何未表现在ITS序列上，这可能与所用分析方法等因素有关，也可能是由于真菌的ITS区序列保守程度高，菌株间的微小差异未表现在ITS区序列上，需要结合其他方法（如RAPD、AFLP等）进一步分析菌株的变异性。对此现象，有待作进一步深入研究探讨。

4 结 论

本研究发现不同的蔓枯病菌菌株致病力存在显著性差异，分离获得的绝大多数蔓枯病菌株的致病力居中或偏强。但不论是不同地理来源和不同致病力的蔓枯病菌菌株之间的ITS序列比较差别不大，说明其ITS区序列的保守程度高，菌株间的分化不明显。由此可以推测，广西地区西、甜瓜上的蔓枯病菌群体比较单一，未产生较大的分化和变异。西、甜瓜蔓枯病菌菌株间ITS区序列保守程度高，分析不同菌株间的变异性或差异性，需结合其他方法（如RAPD、AFLP等）进行进一步深入研究探讨。

参考文献

[1]Amand P C，Wehner T C. Eight isolates of Didymella bryoniae from geographically diverse areas exhibit variation in virulence but no isolate by cultivar interaction on Cucumis sativus[J]. Plant Disease，1995，79（11）： 1136-1139.

[2]吴海波，伊鸿平，冯炯鑫，等. 4种甜瓜蔓枯病菌形态特征及其致病力比较[J]. 新疆农业科学，2008，45（1）： 28-30.

[3]江蛟. 甜瓜蔓枯病及抗病材料鉴定研究[D]. 南京：南京农业大学： 2006.

[4]张永兵，王登明，张聪，等. 甜瓜蔓枯病离体接种方法初步研究[J]. 新疆农业科学，2009，46（3）： 521-525.

[5]陈怀谷，方正，陈厚德，等.小麦纹枯病菌核糖体基因内转录区序列比较[J]. 植物病理学报，2005，35（1）： 24-29.

[6]Bruns T D，White T J，Tayor J W. Fungal molecular systematics[J]. Annual Review of Ecology and Systematics，1991，22： 525-564.