苯胺、硝基苯胺对大蒜根尖细胞的遗传毒性效应

丛娟 李连贵 宫莉

摘要：采用植物细胞核畸变技术，研究了苯胺和硝基苯胺的浓度、染毒时间对大蒜根尖细胞的遗传毒性效应。结果表明，苯胺和硝基苯胺均能抑制大蒜根尖细胞的有丝分裂，诱发较高频率的核畸变。在相同浓度或染毒时间条件下，硝基苯胺的遗传毒性要显著地强于母体化合物苯胺。当溶液浓度为３．０ ｍｇ／Ｌ时，邻硝基苯胺和对硝基苯胺染毒处理４ ｈ、间硝基苯胺染毒处理５ ｈ，可使大蒜根尖细胞微核率和总畸变率均达到最大值，分别为４９．１８‰、４５．６７‰、４３．１３‰和７．９０％、７．３２％、６．９８％，之后随着溶液浓度的增大与染毒时间的延长，微核率和总畸变率呈下降趋势，但均高于对照和苯胺处理。该研究可为苯胺、硝基苯胺环境污染的质量评估提供技术参考。

关键词：苯胺；硝基苯胺；大蒜；根尖细胞；遗传毒性

中图分类号：Ｏ６２３．７３１；Ｓ６３３．４；Ｑ３５５ 文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）06－1142-04

Genetic Toxicity of Aniline and Nitroaniline on the Root Tip Cells of Allium sativum

ＣＯＮＧ Ｊｕａｎ，ＬＩ Ｌｉａｎ－ｇｕｉ，ＧＯＮＧ Ｌｉ

（College ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００１２， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｇｅｎｏｔｏｘｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｉｌｉｎｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ ｏｎ ｒｏｏｔ ｔｉｐ ｃｅｌｌｓ ｏｆ Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅｕｓ ａｂｅｒｒａｎｃｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｂｏｔｈ ａｎｉｌｉｎｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ ｃｏｕｌｄ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ｍｉｔｏｓｉｓ ｏｆ ｒｏｏｔ ｔｉｐ ｃｅｌｌ ｏｆ Ａ． ｓａｔｉｖｕｍ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅ ａ ｈｉｇｈｅｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅａｒ ａｂｅｒｒａｎｃｅ． Ｔｈｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｘｉｃｉｔｙ ｏｆ ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ ｗａｓ ｓｔｒｏｎｇｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ ａｎｉｌｉｎｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｉｍｅ． Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｒｏｏｔ ｔｉｐ ｃｅｌｌｓ ｗｅｒｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｆｏｒ ４ ｈ ｗｉｔｈ ｏｒｔｈｏ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ ａｎｄ ｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ ａｎｄ ５ ｈ ｗｉｔｈ ｍ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ ａｔ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ３．０ ｍｇ／Ｌ， ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｕｓ ｒａｔｅ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ of ４９．１８‰， ４５．６７‰， ４３．１３‰， ａｎｄ ７．９０％， ７．３２％， ６．９８％ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｆｔｅｒ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｎｕｃｌｅｕｓ ｒａｔｅ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ａｂｅｒｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｄｅｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｒｅｎｄ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｔｉｍｅ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ， ｂｕｔ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ａｎｄ ａｎｉｌｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐ． Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ａ ｔｅｃｈｎｉｃａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｉｌｉｎｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｐｏｌｌｕｔｉｏｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ａｎｉｌｉｎｅ； ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｎｅ； Ａｌｌｉｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．； ｒｏｏｔ ｔｉｐ ｃｅｌｌｓ； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｏｘｉｃｉｔｙ

苯胺類化合物是合成染料、制药和橡胶硫化等化学工业产生的重要污染排放物，对环境造成了很大的影响。人体长期接触此类化合物，会引起中枢神经系统、心血管系统及其他脏器的损害，并有溶血作用，可发生溶血性贫血，大量接触还可引起肝损害［１－４］。目前，有关苯胺、硝基苯胺对生物体毒性作用的研究多见于微生物和动物实验方面的报道［２－８］，而对植物细胞的毒害作用研究较少［９，１０］，尤其是遗传致畸方面的研究尚未见报道。试验以百合科（Ｌｉｌｉａｃｅａｅ）葱属（Ａｌｌｉｕｍ Ｌ．）植物大蒜（Ａ. ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）为材料，研究了苯胺、硝基苯胺对大蒜根尖细胞有丝分裂及细胞核畸变的影响，阐明了苯胺、硝基苯胺对大蒜根尖细胞的遗传毒性效应。以期为利用植物检测技术来评价苯胺、硝基苯胺的环境风险提供技术参考。

１材料与方法

１．１材料

供试材料大蒜购于长春市欧亚超市，产地为山东省寿光市。供试药剂苯胺、邻硝基苯胺、间硝基苯胺、对硝基苯胺均为分析纯，配成浓度为１０ ｍｇ／Ｌ的母液，使用时进行梯度稀释；还有Ｃａｒｎｏｙ固定液、ＨＣｌ（１ ｍｏｌ／Ｌ）、醋酸－碱性品红染色液。仪器主要有ＡＬ１０１电子分析天平、ＨＨ－２恒温水浴锅、ＭｏｔｉｃＢＡ３００显微摄录系统等。

１．２方法

将浓度为１０ ｍｇ／Ｌ的苯胺、邻硝基苯胺、间硝基苯胺、对硝基苯胺母液进行梯度稀释，分别配成０．３、０．５、１.0、２.0、３.0、４.0、５.0 ｍｇ／Ｌ的处理溶液，以去离子水为对照。选取大小均匀、无病害的大蒜鳞茎，在２５ ℃、避光环境里水培生根。待根长至１．０～１．５ ｃｍ时，于细胞分裂高峰期部分移入不同浓度的各处理溶液中，进行6 h的染毒处理；另一部分移入各化合物3 ｍｇ／Ｌ的处理液中，染毒时间分别为１、２、３、４、５、６、７、８ ｈ；然后转入去离子水中恢复培养２４ ｈ，Ｃａｒｎｏｙ液中固定２４ ｈ，经ＨＣｌ（１ ｍｏｌ／Ｌ）解离、醋酸－碱性品红染色液染色后，压片镜检。参照文献［１１］、［１２］的标准判定大蒜根尖细胞的微核及畸变细胞。每一处理选取５～６个根尖，约有５ ０００～６ ０００个细胞。统计大蒜根尖的细胞分裂、微核及总畸变细胞数，按下列公式计算大蒜根尖细胞分裂指数、微核率及总畸变率（包括微核、双核、染色体单桥及断片等所有核畸变现象）。

分裂指数＝分裂期细胞数／观察细胞总数×１００％；

微核率＝具有微核细胞数／观察细胞总数×１ ０００‰；

总畸变率＝畸变细胞总数／观察细胞总数×１００％。

所得数据均用ＳＰＳＳ １７．０统计分析软件进行ｔ检验分析。

２结果与分析

２．１苯胺、硝基苯胺溶液浓度对大蒜根尖细胞有丝分裂及畸变的影响

将生长较一致的大蒜根尖组织分别在不同浓度的苯胺和邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺溶液中染毒处理６ ｈ，恢复培养２４ ｈ，结果苯胺和邻硝基苯胺、间硝基苯胺、对硝基苯胺溶液对大蒜根尖细胞分裂指数、微核率、总畸变率的影响情况见图１。由图１Ａ可以看出，当染毒时间一定时，在所选择的试验浓度范围内，苯胺和硝基苯胺对大蒜根尖细胞有丝分裂的影响表现较为一致，即溶液浓度越高，对细胞有丝分裂的抑制作用越强，细胞分裂指数也越低。统计分析显示，当苯胺溶液浓度为１．０ ｍｇ／Ｌ时，大蒜根尖细胞分裂指数降为对照的８４．０％，反映出抑制作用显著（Ｐ＜０．０５）；当苯胺溶液浓度达３．０ ｍｇ／Ｌ以上时，则抑制作用极显著（Ｐ＜０．０１）。而硝基苯胺对大蒜根尖细胞有丝分裂的抑制作用要强于苯胺，当邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺溶液的浓度为０．３ ｍｇ／Ｌ时，其大蒜根尖细胞有丝分裂的抑制作用就已经达到了苯胺溶液浓度为１．０ ｍｇ／Ｌ时的水平，此时的邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺处理的大蒜根尖细胞分裂指数分别为对照的８３．０％、８４．８％和８７．２％，表现出显著的下降趋势（Ｐ＜０．０５）；当邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺溶液浓度达０．５ ｍｇ／Ｌ时，大蒜根尖细胞分裂指数则分别降为对照的６９．１％、７１．４％和７５．９％，差异达到了极显著水平（Ｐ＜０．０１）；并且随着硝基苯胺溶液浓度的进一步增大，细胞分裂指数大幅度下降，当邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺溶液浓度达５．０ ｍｇ／Ｌ时，大蒜根尖细胞分裂指数分别为３．３８％、３．７２％、４．４０％，只有对照的２５．５％、２６．７％和３３．１％。由图１Ｂ和图１Ｃ可以看出，苯胺和硝基苯胺对大蒜根尖细胞均有较强的遗传致畸作用。经ｔ检验分析显示，当苯胺溶液浓度在１．０ ｍｇ／Ｌ时，大蒜根尖细胞微核率为８．６０‰，增加显著（Ｐ＜０．０5）；大蒜根尖细胞总畸变率为１．８５％，增加极显著（Ｐ＜０．０１）；且随着浓度的升高，微核率、总畸变率呈升高的变化趋势。而硝基苯胺溶液浓度在０．１～３．０ ｍｇ／Ｌ范围内，微核率和总畸变率随着浓度的升高而增大；当邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺溶液浓度在０．３ ｍｇ／Ｌ时，与对照相比微核率增加显著（Ｐ＜０．０5），分别为９．１０‰、８．８１‰、７．５２‰；总畸变率增加极显著（Ｐ＜０．０１），分别为１．８６％、１．６７％、１．３９％；当邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺溶液浓度为３．０ ｍｇ／Ｌ时，微核率分别为３８．８０‰、３７．６０‰、３４．０７‰，总畸变率分别为６．８２％、６．３７％、５．６７％，均达到了试验范围内的最高值；但当邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺溶液浓度达3．０ ｍｇ／Ｌ以上后，微核率和总畸变率则表现为下降趋势，其中尤以邻硝基苯胺、对硝基苯胺下降的幅度大，这可能是由于邻硝基苯胺、对硝基苯胺较间硝基苯胺对根尖细胞具有更强的毒性效应、导致死亡细胞增多所致。并且试验中发现，在５．０ ｍｇ／Ｌ浓度处理下，邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺溶液处理均有个别根尖变黑、出现细胞死亡的现象。

２．２苯胺、硝基苯胺染毒时间对大蒜根尖细胞有丝分裂及畸变的影响

以３．０ ｍｇ／Ｌ的苯胺和邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺溶液对大蒜根尖进行染毒处理，改变染毒时间，恢复培养２４ ｈ，结果苯胺和邻硝基苯胺、间硝基苯胺、对硝基苯胺溶液对大蒜根尖细胞分裂指数、微核率、总畸变率的影响情况见图２。从图２Ａ可以看出，当溶液浓度一定时，在试验设定的染毒时间范围内，苯胺和硝基苯胺对大蒜根尖细胞有丝分裂的影响表现较为一致，均表现为随染毒时间的延长其抑制作用增强，使大蒜根尖细胞分裂指数降低，尤以邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺的影响显著。当染毒处理２ ｈ时，邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺处理的大蒜根尖细胞分裂指数分别降为对照的８２．６％、８６．７％、８８．１％，抑制作用显著（Ｐ＜０．０5），并且随着染毒时间的继续延长，细胞分裂指数下降幅度增大；当染毒时间达８ ｈ时，其大蒜根尖细胞分裂指数分别降为对照的２４．３％、２６．８％、３１．５％。从图２Ｂ和图２Ｃ可以看出，在试验设定的染毒时间内，苯胺处理随着染毒时间的延长，大蒜根尖细胞的微核率和总畸变率均呈升高的变化趋势；而邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺处理则呈现出先升高后下降的变化趋势，均表现出对大蒜根尖细胞有较强的遗传致畸作用。经ｔ检验分析显示，当染毒处理为２ ｈ时，邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺处理的大蒜根尖细胞微核率分别为１６．１２‰、１４．０５‰、１１．００‰，总畸变率分别为２．８４％、２．６７％、２．４６％，与对照相比差异均为极显著（Ｐ＜０．０1），且随着染毒时间的延长微核率和总畸变率大幅度升高，当邻硝基苯胺、对硝基苯胺染毒处理４ ｈ和间硝基苯胺染毒处理５ ｈ时，其微核率和总畸变率均达到最大值，分别为４９．１８‰、４５．６７‰、４３．１３‰和７．９０％、７．３２％、６．９８％，之后随着时间的延长微核率和总畸变率下降。当染毒处理达８ ｈ时，邻硝基苯胺、对硝基苯胺、间硝基苯胺处理的微核率和总畸变率分别降为２３．４７‰、２５．２６‰、２９．２８‰和４．４４％、４．６５％、５．０２％，但仍高于苯胺处理。并且部分根尖变色甚至出现死亡。这表明随着染毒时间的延长，有害物质在大蒜根尖细胞中大量积累，毒害作用增强，导致根尖分生组织细胞死亡，使大蒜根尖细胞分裂指数、微核率和总畸变率明显下降。

２．３苯胺和硝基苯胺对大蒜根尖细胞遗传毒性的综合分析

对图１、图２进行综合分析，可以看出，在相同浓度或染毒时间条件下，硝基苯胺对大蒜根尖细胞有丝分裂的抑制作用和遗传致畸作用都要明显地强于母体化合物苯胺。这可能是由于－ＮＯ２的引入，大大增加了母体结构的亲核反应活性，改变了苯胺类化合物与细胞内蛋白质、ＤＮＡ及ＤＮＡ合成、ＤＮＡ修复、细胞分裂有关的酶类等大分子物质的结合能力，使其毒性增大，干扰细胞内正常的物质代谢过程［５，６］，其结果是一方面延缓或抑制了细胞有丝分裂的进程，使细胞分裂指数降低明显；另一方面，引起了细胞中ＤＮＡ和染色体损伤、纺锤体出现紊乱以及影响细胞分裂后期细胞板的形成等，从而导致细胞分裂及染色体出现异常，产生双核、微核、染色体单桥、断片等畸变现象（图３），致畸效应明显。

苯胺和硝基苯胺对大蒜根尖细胞的遗传毒性效应与溶液浓度和染毒时间有着直接的关系。在试验设定的条件内，苯胺和硝基苯胺对大蒜根尖细胞有丝分裂的抑制作用均随着溶液浓度的升高和染毒时间的延长而增强。在遗传致畸方面，苯胺处理的大蒜根尖细胞微核率和总畸变率均随着溶液浓度的升高和染毒时间的延长而增大；而硝基苯胺处理在一定浓度和一定的处理时间范围内，大蒜根尖细胞微核率和总畸变率随着溶液浓度的增大和处理时间的延长而升高，但超过一定范围后，却呈下降变化；这是由于随着溶液浓度的升高和染毒时间的延长，进入细胞中的有害物质增多，对细胞的毒害作用增强，导致死亡的根尖细胞增多所致。尤以邻硝基苯胺、对硝基苯胺的影响最为显著，当溶液浓度为３．０ ｍｇ／Ｌ、染毒处理４ ｈ时，大蒜根尖细胞微核率和总畸变率均达到最大值，分别为４９．１８‰、４５．６７‰和７．９０％、７．３２％，间硝基苯胺的影响稍弱。这一结果与于瑞莲等［６］研究的硝基苯胺对发光菌、苏丽敏等［７］研究的硝基苯胺对大型蚤以及王月等［８］研究的硝基苯胺对牛血清白蛋白的毒性作用结果较为一致。

此外，观察还发现，随着溶液浓度的增加和染毒时间的延长，大蒜根尖细胞的畸变细胞种类也明显增多，在畸变的细胞中尤以微核细胞居多，这可能是由于诸如染色体单桥、断片、滞后等多种畸变现象在间期时均表现为微核所致［１１，１２］。

３小结

试验证明，苯胺和硝基苯胺均能抑制大蒜根尖细胞有丝分裂，具有直接和间接的ＤＮＡ损伤作用，能引发较高频率的细胞核畸变，表现出一定的遗传毒性。硝基苯胺的毒性作用明显强于其母体化合物苯胺，并且毒性大小与取代基位置密切相关，其排序为邻位＞对位＞间位。

苯胺和硝基苯胺对大蒜根尖细胞的遗传毒性效应与溶液浓度和染毒时间都有着直接关系，在试验设定的浓度和时间范围内，它们对大蒜根尖细胞有丝分裂的抑制作用均随着溶液浓度的升高和染毒时间的延长而增强；在遗传致畸方面，苯胺作用的大蒜根尖细胞微核率和总畸变率均随其浓度升高和染毒时间延长而增大，而硝基苯胺作用的大蒜根尖细胞微核率和总畸变率是随其浓度的增大和处理时间的延长先升高，达最大值后下降，但仍高于对照与苯胺处理。

研究结果表明，大蒜根尖细胞在其分裂高峰时期，对环境中苯胺类污染物的种类及溶液浓度和染毒时间变化极为敏感，核畸变现象易于观察，在一定的污染浓度和染毒时间范围内，大蒜根尖细胞微核率和总畸变率与污染程度呈良好的正相关关系。且本方法材料易得、操作简便、同步性好，结果易于统计和分析，不失为一种利用植物检测技术来评价苯胺和硝基苯胺环境风险的好方法。

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