基于蛋白A－纳米金－丝网印刷电极的雌二醇免疫传感器*

杨 勇，牟婧男，丁亚萍，王俊霞，李健爽，杜晓燕*，常 东

(1.哈尔滨医科大学公共卫生学院，哈尔滨150081;2.哈尔滨医科大学附属第一医院，哈尔滨150001)

环境雌激素EEs(Environmental Estrogens)可通过污水、食品、药品等进入到机体当中［1］，进而危害机体的生殖系统、神经系统、免疫系统等，并且可对肿瘤的发生产生影响［2－3］。在各种环境雌激素中，甾类雌激素的危害较大［4］。雌二醇是一种甾类雌激素，有α、β两种构型，其中17β－雌二醇生物活性最强。目前报道的雌二醇测定方法有高效液相色谱法［5］、液相色谱－质谱联用法［6］、气相色谱－质谱联用法［7］及各种免疫分析法［8－9］等。基于免疫反应的电化学传感器，分析时间短、操作简便且灵敏度较高，利于实现对样品的实时、现场、在线测定。相比放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光免疫法(FIA)、化学发光免疫分析法(CLIA)等免疫测定方法，电化学免疫传感器是将抗体固定到电极表面，方便与未反应的雌二醇抗原分离，每次测定仅消耗几微升的试剂和样品，因此免疫传感器在测定激素类物质中具有很好的应用前景［10］。

蛋白A对抗体具有定向固定作用，能使抗体上与抗原决定簇发生结合的活性片段一致朝外［11］，避免了固定抗体取向的杂乱无章，可提高抗体的利用效率，并且蛋白A可避免抗体直接接触金属而失活。本研究选择一次性丝网印刷电极作为基础电极，印刷电极制作简单方便、成本低、重复性好，最重要的是印刷电极可实现快速平行测定，更利于实际应用和商品化［12］。应用电化学法将纳米金沉积在丝网印刷电极的工作电极上，通过改变实验参数有效地控制了纳米颗粒的大小和密度。在纳米金上固定蛋白A，通过蛋白A分子定向固定抗17β－雌二醇抗体。利用辣根过氧化物酶标记的雌二醇和样品中的雌二醇与固定化抗体发生酶免疫竞争反应，测定样品中17β－雌二醇含量。实验结果表明以蛋白A为载体固定抗体后能够很大地提高免疫反应的检测灵敏度，且辣根过氧化物酶对硫堇－过氧化氢体系有很好的催化作用，酶底物产生灵敏的电流信号。尿液中雌二醇含量可反映机体对环境雌激素的接触量，在临床上测定内源性雌激素有一定的意义，所以选择人体尿液作为测定对象，研究表明该免疫传感器对人尿液中雌二醇的测定结果较好。

1 实验部分

1.1 仪器

CHI660A电化学工作站(上海辰华仪器公司);扫描电子显微镜－QUANTA200F(美国FEI公司);超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司);电热恒温培养箱(上海市跃进医疗器械一厂);高速离心机(上海安亭科学仪器厂);丝网印刷电极(南京天鼎生物技术研究所)。

1.2 试剂

蛋白A(美国IL公司);硫堇(英国Alfa Aesar公司);氯金酸(美国Acros Organics公司);17β－雌二醇(德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司);辣根过氧化物酶标记的17β－雌二醇(天津天健生物制药公司);磷酸盐缓冲片(PBS，pH7.4)、兔抗17β－雌二醇抗体、牛血清白蛋白(BSA)均来自美国Sigma公司;甲醇为色谱纯，其它试剂均为分析纯;实验用水为超纯水。

1.3 实验方法

1.3.1 免疫电极的制备

实验中的电极如图1，工作电极:直径2.5 mm，银底碳电极;对电极:银底碳电极;参比电极:银－氯化银电极。取同一批次的电极用无水乙醇和去离子水各超声清洗5 min，然后在0.1 g/L氯金酸溶液中用恒电位法(－0.2 V)沉积60 s，沉积前先向氯金酸溶液中通入高纯氮气20 min以除氧，沉积后用去离子水清洗表面，用高纯氮气吹干。

图1 丝网印刷电极的组成

取5 μL浓度为1 g/L蛋白A溶液滴加到工作电极表面，4℃冰箱中过夜，然后反复清洗表面，室温干燥。取5 μL浓度为0.1 g/L兔抗17β－雌二醇抗体溶液滴加到工作电极上，放入37℃恒温培养箱中温育1 h，PBS清洗后用1%的BSA在4℃冰箱中封闭2 h，反复清洗，最后在工作电极表面滴一滴pH7.4的PBS，放入4℃冰箱备用(每一步反应结束后都用pH 7.4的PBS反复清洗以除掉未结合的试剂)。

1.3.2 标准系列的测定

用10%的甲醇将17β－雌二醇配成一系列标准溶液，分别取4 μL标准液和4 μL酶标17β－雌二醇(稀释倍数为1∶100)滴加到免疫电极的工作电极上，用微量加样器在电极表面轻轻混合3次，放入37℃恒温培养箱中温育30 min，用PBS反复清洗后在1 mmol/L 的硫堇［13］+0.03%H2O2溶液(pH5.5乙酸盐缓冲液配制)中用循环伏安法测定还原峰电流值，峰电流与雌二醇含量呈负相关。

1.3.3 尿中17β－雌二醇的测定

分别收集正常男性和女性尿样各10例测定。尿中的17β－雌二醇主要以结合态的形式存在，为了不影响免疫反应，首先要对其进行解离。采用酸水解法［14］，取0.5 mL尿样于4 mL具塞离心管中，加入0.05 mL浓盐酸和0.5 mL甲醇，80℃水浴1 h，然后用5 mol/L的NaOH 溶液调 pH 至7.0 ～7.5，用 pH 7.4 的 PBS 稀释到4 mL，此时尿样稀释8倍，10 000 rot/min高速离心10 min后，取上清液检测，测定步骤按照2.3。

2 结果与讨论

2.1 修饰纳米金条件的优化及表征

电极在0.1 g/L氯金酸溶液中，经不同时间沉积后，测定硫堇－过氧化氢体系的还原峰电流值。随着沉积时间的增加硫堇－过氧化氢体系的还原电流逐渐增大，当沉积时间增加到60 s以后峰电流变化不大，结果见图2。对沉积时间为60 s的电极进行扫描电镜表征，结果如图3所示，金颗粒的平均粒径小于30 nm，一致性较好。因此选择在0.1 g/L氯金酸溶液中－0.2 V电压下沉积60 s作为沉积条件。

图2 纳米金沉积时间对响应信号的影响测试底液为1 mmol/L、pH 5.5 的硫堇+0.03%H2O2溶液(Scan rate:100 mV/s)

图3 沉积时间为60 s的扫描电镜图

2.2 修饰电极的循环伏安法表征

用循环伏安法表征不同修饰阶段的电极，如图4所示。与裸电极相比，修饰纳米金后电极在硫堇－过氧化氢溶液中的响应电流增大，这是因为修饰了纳米金后电极比表面积增大，有利于电活性物质的电化学反应、另外修饰纳米金后也加快了电极的电子传递。当纳米金上吸附蛋白A后响应电流下降，因为蛋白A大分子阻碍了电子传递。当蛋白A上固定抗体后电流再次下降，因为抗体为大分子蛋白质进一步阻碍电子传递。抗体与酶标抗原结合后电流有较大幅度的增长，是酶催化作用的结果。

图4 修饰电极的循环伏安法表征图测试底液为1 mmol/L、pH 5.5 的硫堇+0.03%H2O2溶液(Scan rate:100 mV/s)

2.3 蛋白A的作用

比较了未修饰和修饰蛋白A电极的测定信号，如图5所示。修饰了蛋白A的电极，经固定抗体和免疫反应后，测定硫堇－过氧化氢体系的还原电流信号明显增强，而相比之下，未修饰蛋白A的免疫电极测定信号小很多。由此得知蛋白A在电极的修饰过程中起到重要的作用，可增加抗体固定量并介导抗体有序定向修饰，提高抗体利用率;并且避免了抗体直接固定到纳米金上易失活、在洗脱过程中易脱落的问题，进而提高免疫反应的灵敏度，所以对电流响应有明显增强作用。该免疫传感器与17β－雌二醇在玻碳电极上的直接差分脉冲伏安法测定比较，灵敏度提高约4个数量级［15］。

图5 蛋白A对测定信号的影响测试底液为1 mmol/L、pH 5.5 的硫堇+0.03%H2O2溶液(Scan rate:100 mV/s)

2.4 温育时间对测定的影响

考察了温育时间对抗原抗体反应的的影响，结果如图6所示。随温育时间的增加，响应信号增大，表示免疫反应需要足够的时间才能完成。当温育时间超过30 min后还原峰电流不再增加，说明免疫反应已趋于稳定，所以选择30 min作为温育时间。

图6 温育时间对最后测定信号的影响

2.5 标准曲线

在优化条件下，用修饰好抗体的免疫电极对17β－雌二醇标准系列进行测定，标准液中17β－雌二醇含量与酶催化的硫堇－过氧化氢体系还原峰电流呈负相关，见图7。17β－雌二醇含量在0.1 μg/L ～20 μg/L范围内与被测信号有良好线性关系，R2=0.9899，线性回归方程为 y=3.8508－0.4843lgc(P＜0.05)，检出限为0.035 μg/L，图8 显示不同浓度 17β－雌二醇的实际测定曲线。

图7 测定17β－雌二醇的标准曲线

图8 循环伏安法测定不同浓度17β－雌二醇从下到上17β－雌二醇浓度依次为0、0.1 μg/L、1 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L

2.6 方法精密度

选用浓度为1 μg/L和10 μg/L两个标准溶液分别平行测定8次，结果见表1，响应信号的RSD%均小于1%，该方法一致性较好。

表1 方法精密度

2.7 样品分析

取正常男性和女性(年龄在23岁～28岁)尿样各10份，测定雌二醇含量，结果见表2。男性尿样中17β－雌二醇含量在0～7 μg/L之间，女性由于受排卵周期的影响尿样中17β－雌二醇含量范围较宽，在10 μg/L～100 μg/L之间，结果与用色谱法测定的相关报道一致［16］。选择男女各1份尿样对精密度进行考察，结果如表3，RSD%＜10%，一致性较好。选择男女各3份尿样考察回收率，结果如表4，回收率在96%～114%范围内。在免疫电极表面滴上一滴pH 7.4的PBS，放入4℃冰箱7 d，对同一样本的测定信号仅下降1%，说明该传感器稳定性较好。

表2 人体尿样中17β－雌二醇的测定

表3 人体尿样中17β－雌二醇测定的精密度分析

表4 人体尿样中17β－雌二醇含量的加标回收率测定

3 结论

本文研究了基于纳米金和蛋白A修饰电极的免疫传感器，对17β－雌二醇的测定显示了非常高的灵敏度，测定实际样品结果较好，有望应用于环境、食品、动物体液中该物质的快速测定，对于其它激素类物质的测定也有一定借鉴价值。

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