流式细胞术检测健康成年人淋巴细胞亚群

赵鹏飞，陈坤，赵要顺，蔺 强 ，汤桂梅

（华北油田总医院肿瘤科，河北任丘 ，062552）

随着艾滋病、自身免疫病及各种肿瘤的发病率的上升，人们对这些疾病的发病机理、病程发展、治疗效果进行深入研究发现疾病的发生与机体免疫功能状态密切相关。淋巴细胞是构成免疫系统和执行免疫功能的主要细胞群体。进行淋巴细胞亚群分析，对于了解机体免疫功能状态有重要的临床意义。淋巴细胞受生态环境、社会经济等多种因素影响，不同地区、不同种族存在差异，国内、国外近年来不断调查研究，纷纷建立本国或本地区的健康人群参考范围［1］。健康人群外周血淋巴细胞亚群正常参考范围建立，是监测和评价机体免疫功能的基础，对疾病诊断分期、治疗评价、预后判断有重要指导意义。我们就这一问题综述如下：

1 淋巴细胞检测方法［2］

1.1 形态学观察

依据淋巴细胞转化的形态学特征，借助光学显微镜进行检测。优点：方法学较简单，无需特殊仪器设备。缺点：依靠肉眼观察形态学变化，准确性差。

1.2 放射性核素（3H-TdR）掺入法

增殖的细胞胞内新合成DNA需摄取核苷酸原料，应用核素标记的核苷酸参与反应，通过测定放射性强度可反映淋巴细胞增殖水平。优点：灵敏，可自动操作。缺点：实验结果重复性差，存在放射污染危险。

1.3 MTT比色法

活细胞内有活性的线粒体作用于MTT，可生成蓝色甲产物，其生成量与细胞代谢活跃程度呈正比，通过比色可间接定量分析细胞增殖水平。此方法敏感，经济，无放射性污染，但重复性差。

1.4 流式细胞术

流式细胞仪结合现代单克隆抗体技术，可同时鉴别单个细胞上的多种参数定量定性分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。

流式细胞术进行淋巴细胞免疫表型分析已逐渐成为临床检验的常规工作之一，在各地区广泛使用［3］。

2 淋巴细胞亚群分析

利用各种单克隆抗体与淋巴细胞表面的抗原结合，再配合多色荧光染料，通过流式细胞仪检测分析即可以把各种不同功能的淋巴亚群区分开来，进而得到各亚群的相对比例。最常检测的亚群包括T细胞（CD3）、B细胞（CD19）、NK细胞（CD16+56）、辅助性T细胞（CD3+CD4+）和抑制性T细胞（CD3+CD8+）等等。

2.1

T淋巴细胞反映细胞免疫功能，免疫缺陷和自身免疫性疾病与T淋巴细胞的含量有着紧密联系。CD3是T细胞的特异性抗原，可用CD3来区分全部T细胞。根据各亚群的特异性志，T淋巴细胞可分为CD3/CD4双阳性细胞和CD3/CD8双阳性细胞，CD3/CD4双阳T细胞即辅助/诱导性T细胞，具有协助体液免疫和细胞免疫的功能，是HIV病毒感染的主要对象，CD4受体是HIV病毒入侵的主要途径。因此CD4+T淋巴细胞绝对计数被用于评价HIV感染后免疫系统受损的程度［4］。CD3/CD8双阳T细胞即抑制/细胞胞毒性T细胞，具有抑制细胞免疫及体液免疫的功能，以及杀伤靶细胞的功能。 CD4/CD8的比值用于评价自身免疫失调或被怀疑是免疫失调以及免疫缺陷病患者的免疫状态，在器官移植后免疫重建、移植后免疫监测以及实体肿瘤疗效观察中有重要临床意义。

2.2

B淋细胞通过表面的CD19抗原可以从淋巴细胞中分离出来。通过产生各种自身抗体、抗细菌抗体及致病性抗体，发挥体液免疫功能，从而维持机体自身稳定。

2.3

NK细胞是不同于T、B淋巴细胞，具有直接杀伤靶细胞效应的一类淋巴细胞。NK细胞杀伤效应的靶细胞有肿瘤细胞、病毒或细菌感染的细胞以及机体某些正常细胞，具有抗肿瘤、抗感染、免疫调节等功能，从而行使免疫监视功能，在抑瘤及抗肿瘤转移方面起重要作用［5］。

3. 淋巴细胞亚群差异

3.1 地区差异

各地区的生活环境、生存条件、遗传因素不同，各地区正常人群淋巴细胞亚群存在差异。 Klose等研究比较发现，德国布基那法索地区、新加坡和坦桑尼亚地区正常成年人T细胞绝对值(1801cells/ul vs.1550cells/ul vs. 1431cells/ ul )、B细胞绝对值（349cells/ul vs. 335cells/ul vs.253cells/ul）及CD4+T细胞（1082cells/ul vs. 814cells/ul vs. 833cells/ul).有显著差异［6］。Vithavasai等研究发现，泰国人CD3+、CD4+T细胞绝对值、百分数明显低于高加索人［7］。国内相关报道中，与高加索人和美国人相比，中国人的CD3+CD8+细胞和NK细胞(CD3-，CD16+和/或CD56+)的相对值(百分率)与绝对值均高，CD3-CD19+细胞和CD3+CD4+细胞仅相对值较低，但绝对值不少.CD4+/CD8+比值向低值漂移［8］。浙江省与北京地区健康成年人相比，T细胞绝对值（1539cells/ul vs.1907cells/ul；P ≤ 0.005)有显著差异［9］，这种差异也存在于国内其它地区［10］［11］［12］。因此在不同地区应建立本地区统一的正常参考值范围。

3.2 年龄差异

随着年龄增长，正常人群淋巴细胞各亚群也相应发生变化。Bisset等研究发现，年轻组(＜50岁)与老年组(＞50岁)相比，T细胞百分比 (73.45% vs.69.20%; P ≤ 0.05)、绝对值(1257 cells/ul vs. 996 cells/ul; P ≤ 0.005)、CD4+T细胞绝对值(737 cells/ul vs.653 cells/ul; P ≤0.05)、CD8+T细胞绝对值(439 cells/ul vs.302 cells/ul; P ≤ 0.005)有显著差异［13］。焦阳等研究发现，国内人群不同年龄组淋巴细胞亚群存在较大差异。青年组（19-44岁）、中年组（45-64岁）、老年组（＞65岁）三组相比，B细胞绝对值、T细胞绝对值、CD8+T细胞绝对值有显著差异［14］。

3.3 性别差异

Uppal等研究发现在印度成年人中，女性CD4+T细胞绝对值及CD4+T百分比高于男性，有统计学意义（P ≤0.05），男性CD8+T细胞绝对值高于女性，有统计学意义（P≤0.01）［15］。Choong 等研究发现在马来西亚华人中，女性CD4+/+CD8+比值显著高于男性［16］。吴引伟等研究发现男女之间CD3+、CD3+CD4+及CD3-CD(16+56)+细胞数有显著性差异(P＜0.01)［11］。郭志伟等研究发现男性和女性的CD3+的百分率和CD3+CD4+百分率和绝对数均有差异，表现为女性高于男性。而CD3+绝对数和CD3+CD8+百分率和绝对数没有性别差异［9］。宁铁林等研究发现天津地区成年人CD4细胞在不同性别、年龄间差别无统计学意义(P＞0.05)［17］，陈霞等研究发现乐山地区健康成年人CD3、CD4在性别和年龄上差异均无统计学意义［18］。

3.4 民族差异

在同一地区，不同民族之间也存在着差异。张琰等研究75例维吾尔族和104例汉族健康成人发现，两民族在辅助性T细胞水平、NK细胞、B细胞上的差异有统计学意义;维吾尔族与汉族男性在辅助性T细胞及CD4/CD8比值上的差异有统计学意义，前者略低于后者;维吾尔族女性NK细胞显著高于汉族(P＜0.01)［19］，刘帅凤等研究发现CD4和CD4/CD8在民族分布上(汉族79名、壮族31名)的差异有显著的统计学意义(P＜0.05)［20］。卫大英等研究彝族［21］、贺健梅等研究苗族［22］、段松等研究傣族［23］发现，各族健康成年人CD4在绝对数上无明显民族差异。

随着流式细胞仪的广泛使用以及生物技术的深入进展，对外周血淋巴细胞亚群的分群和功能有了更深入的了解。建立健康成年人外周血淋巴细胞亚群正常参考值范围，是进行病人免疫功能监测、研究病人免疫功能变化的基础工作，美国［24］、意大利［25］、土耳其［26］等国已经建立了本国统一的淋巴细胞亚群参考值范围，其中意大利全国53个流式细胞实验室参加，调查了1311名人群，严格按照标准化的实验操作，使调查结果具代表性、准确性和权威性。我国一些地区也进行了本地区淋巴细胞正常参考值调查，但在仪器使用、人员操作、抗体使用、样本选择上没有一个统一标准，因此在结果上缺乏代表性、可比性。我们期待在全国有组织地选取多个流式细胞实验室，严格按照SENIEUR原则［27］选取大样本，实验标准化操作，充分考虑地区、年龄、性别和民族差异，及早建立具中国代表性、准确性和权威性的淋巴细胞亚群正常参考值范围，为我国临床疾病的诊治及治疗提供客观依据，从而确定我国艾滋病分期及诊治标准。

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