人宫颈鳞状上皮细胞癌组织中IKCa1 mRNA的表达及意义

林海蕤，毛熙光，王定玉

(泸州医学院附属医院，四川泸州646000)

大量研究证实离子通道是调控细胞生长、分化和增殖等生理功能的结构单元之一，其功能或结构的异常多与如恶性肿瘤等重大疾病的发生及发展有关。1991～2008年以来，研究者发现钙激活性中电导钾离子通道(IKCal)在大量的恶性肿瘤组织中呈现高表达［1，4］，但尚缺乏其在宫颈癌中的表达研究。2009～2011年，我们从携带着遗传信息的IKCalmRNA方面着手寻找宫颈鳞状上皮细胞癌(简称宫颈癌)与正常宫颈上皮组织中IKCalmRNA表达的差异，尝试从分子水平探讨IKCal在宫颈癌发生中所起的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择在我院手术切除病理存档的宫颈癌标本15例，均经病理检查确诊，平均年龄40.5岁，手术病理分期Ⅱa期;另选同期因子宫肌瘤等疾病进行子宫全切除术标本共18例(患者平均年龄51岁)为对照，病理检查证实宫颈组织正常。

1.2 主要试剂和仪器 逆转录及PCR试剂盒购自大连宝生物公司;引物序列通过GenBank核酸数据库检索到的目的基因与参照基因引物序列，Oligo 5.0软件设计引物，并经NCBI BLASTn分析软件验证，符合引物要求后送上海生工生物公司合成;2×Taq PCR MasterMix(TIANGEN公司);100 bp DNA Ladder(TIANGEN公司)等。高速低温离心机(美国科俊公司);DYY-8c型电泳仪(北京六一仪器厂);定量PCR仪iCycler(美国BIO-RAD公司);倒置显微镜及图像分析系统(日本Olympus);蛋白质核酸测量仪ND-100(上海基因公司);凝胶成像及分析系统LAS-300(日本FUJIFILM)。

1.3 IKCal mRNA检测方法 ①提取总 RNA:按Trizol一步法分别提取正常宫颈上皮组织及宫颈癌组织的总RNA;并用分光光度计测定总RNA的浓度，经1%琼脂糖凝胶电泳证实均有清晰的18 S和28 S条带。②合成cDNA:按逆转录试剂盒说明操作合成cDNA，使用IKCal引物序列如下:上游为5'-GTGCGTGCAGGATTTAGGG-3'，下 游 为 5'-TGCTAAGCAGCTCAGTCAGGG-3';内参GAPDH引物序列如下:上游为5'-GGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3'，下游为5'-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3'。③PCR反应:扩增体系为引物(上游引物和下游引物各1.0 μL)2.0 μL，反应液 12.5 μL，cDNA 1 μg，反应体系总体积25 μL。反应条件为94℃ 4 min，94℃ 45 s、56℃ 45 s、72℃ 1 min共30循环，72℃延伸5 min。④取20 μL PCR产物分别进行2%琼脂糖凝胶电泳(0.5μg/mL溴化乙锭染色)，鉴定扩增的 PCR产物，并通过凝胶成像及分析系统对电泳图片进行拍照，分析各特异扩增条带的原始吸光度(A)值，以IKCal与GAPDHA值的比值为组织中IKCal mRNA的相对表达量。

1.4 统计学方法 电泳图像采用Multi Gauge分析软件定量分析后，数据用SPSS11.5统计软件行随机独立均数比较的Independent-Samples t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

产物基因片段位于200～900 bp，其中参照基因片段约为300 bp，目的基因片段约为800～900 bp，电泳结果显示扩增出的目的基因片段分子量大小与预期目的基因片段符合。宫颈癌组织中IKCal mRNA阳性表达11例(73.33%)，阳性表达量为1.14±0.45;宫颈正常组织中阳性表达 2例(11.11%)，阳性表达量为 0.86 ±0.23(P 均 ＜0.05)。

3 讨论

mRNA承载着从DNA转录来的遗传信息，并承担着将其转运至细胞质中核糖体指导蛋白质合成的功能。通过对组织中IKCal mRNA的检测，可以了解IKCal在该组织中合成的水平及其含量。在对细胞有丝分裂过程的研究中发现［5，6］，大量存在的IKCal通道蛋白可造成宫颈上皮细胞内外Ca2+浓度的失衡，并作为转化生长因子(TGF)介导的信号传导通路中的效应元件参与细胞有丝分裂的调控，使细胞脱离静止期，促使细胞由G1期向S期发展，造成正常的有丝分裂过程失控。使用药物阻断IKCal，则会使细胞停留在G0期而停止细胞增殖过程［7］。经研究发现，IKCal在子宫内膜癌［4］、乳腺癌［3］、前列腺癌［2］及胰腺癌［9］等恶性肿瘤组织中呈高表达，在离体培养的肿瘤细胞中使用IKCal阻断剂可以在很大程度上抑制肿瘤细胞的增殖。用IKCal通道阻断剂克霉唑处理宫颈癌Hela细胞后，可以观察到克霉唑以浓度和时间依赖的方式抑制HeLa细胞的增殖，下调 IKCal mRNA的表达水平，诱导细胞凋亡［10］。也有研究［11］发现 IKCal在淋巴细胞、鼠成纤维细胞、血管平滑肌细胞以及多种癌细胞株的有丝分裂过程IKCal通道表达上调，是细胞增殖过程中的重要调节因子。同时，IKCal在内皮细胞存在表达，且参与内皮的增殖过程［12］。过度表达的IKCal可以通过影响细胞增殖特性而导致细胞增殖和凋亡比例失调，同时它还可以通过改变恶性肿瘤细胞的迁徙能力、肿瘤血管通透性、血管增殖能力等因素，导致恶性肿瘤具有转移和复发的特性［13］。

本研究通过对15例宫颈癌组织IKCal mRNA相对定量检测后发现，出现IKCal目的基因条带者11例，阳性表达率为73.33%，表达水平为1.14±0.45;均高于正常宫颈组织中的2例、11.11%和0.86 ±0.23;P 均 ＜0.05。由此可见，宫颈癌组织与正常宫颈组织中IKCal mRNA表达存在统计学差异，该结果与目前文献［14］报道的IKCal在恶性肿瘤组织中的表达情况相一致。与正常宫颈组织比较，宫颈癌组织中IKCal mRNA表达明显上调，这可能与宫颈癌组织中IKCal蛋白的合成较正常宫颈组织旺盛有关。过度表达的IKCalm RNA可指导合成相关的功能性蛋白质，从而为细胞增殖创造了较高的IKCal蛋白表达环境，促使大量的宫颈鳞状上皮细胞进入增殖期，使有丝分裂过程失控造成异常的细胞增殖［7］。由于IKCal具有调节细胞膜电位及细胞内外Ca2+浓度的功能，细胞中大量增多的IKCal可能使细胞内Ca2+浓度增加，干扰由Ca2+调控的宫颈正常细胞存活、增殖、分化等生理活动，尤其是对细胞周期中大量合成RNA和蛋白质的G1期影响更为明显。曾有研究者［15］通过阻断 IKCal通道将细胞阻滞于G1早期，使其停止或减慢细胞的增殖而达到促进肿瘤细胞凋亡的目的。过度表达的IKCal造成宫颈上皮细胞有丝分裂过程的失控，可能是宫颈癌的发生机制之一。

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