组织工程血管移植在血液透析通路中的应用

张 攀 综述 叶朝阳 审校

目前维持性血液透析(HD)患者使用的血管通路主要是动静脉内瘘(AVF)、移植血管和带涤纶套中心静脉导管。主流观点认为AVF首选[1]，移植血管其次[2]，最后考虑静脉导管[3]。K-DOQ指南认为移植血管只用于自体AVF不能成熟、内瘘闭塞或者血管解剖条件不适合做内瘘的患者。移植血管的来源一般为患者自体血管、尸体血管、异种(动物)血管及人造血管。最好的移植血管是患者自体血管，一般是大隐静脉[4]。脱细胞牛颈静脉和人尸血管易发生血栓、动脉瘤及钙化，在临床上未广泛接受[5-7]。聚四氟乙烯(PTFE)人造血管多用于口径>6 mm的HD患者的移植血管通路。研究表明PTFE人造血管在一、二级通畅率，感染风险及住院风险上均次于自体AVF，但好于静脉导管[2]。尽管PTFE人造血管使用广泛，但相对于自体移植血管仍然存在明显不足[8,9]，易发生感染、血栓、内膜增生、流出道或吻合口闭塞等[4,10]，平均通畅时间仅10月左右。此外，人工材料生物兼容性较差，不利细胞的正常生物行为[11]，也易造成移植性炎症反应[12]。

组织工程是一种应用细胞生物学和工程学原理,将人体某部分的组织细胞种植和吸附在一种生物材料的支架上进行人工培养繁殖,扩增,然后移植至人体内所需要部位,从而达到器官修复或再造的治疗目的的技术。随着组织工程技术的进步，组织工程血管(tissue-engineered blood vascular，TEBV)越来越多地应用于临床。Shin’oka等[13,14]率先应用自体骨髓干细胞-高分子材料种植技术构建组织血管，并成功用于压力较低的儿童患者肺动脉流出道的修复。然而这种方法构建的血管不具备足够的机械强度，不能用于成人的动脉搭桥。其他用类似方法构建的血管也未能获得足够应用于临床的抗压强度[15,16]。要将TEBV用于制作透析血管通路，必须要使构建的血管获得足够的机械强度与生物兼容性。为此，国外的专家已经进行了初步的尝试并取得了令人鼓舞的成果。

分层构建法构建的TEBV

分层构建法与简化分层构建法1998年出现的分层构建法，可获得具有足够机械强度的TEBV。L’Heureux等[17]采用三种血管细胞预先培养再组合形成具板层结构类天然血管的纯生物材料。他们先分别培养人脐静脉平滑肌细胞(smooth muscle cell，SMC)和人皮肤成纤维母细胞(fibroblast，FB)于培养瓶，用条件化培养液培育30d后，形成由细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)构成的膜片状培养物。将FB膜片从瓶壁上剥离，包裹在惰性管轴外继续培养，在成熟期膜片相互紧密黏合，产生圆柱状培养物。FB管膜经脱水处理制成无细胞的内膜。组装时，(1)将内膜套在PTFE多孔管轴外，轴外径3 mm，再裹上SMC膜片，制作血管中膜，此时将构建物置于生物反应器，培养液同时通过管腔和管外回流，支持管壁细胞生长；(2)裹上FB膜作为外膜，待管壁细胞和ECM培育成熟；(3)脱去中心管轴，管内接种内皮细胞(endothelial cells，EC)总时程3月培育出了具有活性细胞的，并且类似机体血管板层结构的TEBV。该血管壁SMC和EC都表现出分化状态，血液相容性好，能耐受2 000 mmHg的静水压，动物体内短期移植(7d)显示易于手术操作,缝合性良好。这种TEBV制成，是血管组织工程领域一大突破，显示了通过细胞成分培养构筑功能性血管的可能性。

此后，Peck等[18]对上述分层构建法进行了简化，以成纤维母细胞为种子，培养8周形成生物膜后，包绕在有PTFE涂层的不锈钢轴上继续培养10周，使其形成管状胶原支架。此方法的特点是取消了中层的SMC，其优势在于减少血管培养所需的细胞类型，进而减少培养细胞所需要的培养条件和附加质量控制措施。虽然在自体血管中SMC层的收缩功能在血压控制中发挥着重要的作用，但对移植血管的通畅性并无明显影响。此外，血清培养的SMC细胞具有高增生性，取消中层的SMC也就避免了内膜增生的风险[19]。

简化分层构建血管在动物模型上的研究2006年L’Heureux等[20]一系列成功的动物实验证明了这种简化的TEBV的有效性,被命名为“LifelineTMgrafts”，构建血管的细胞取自56～79岁的血管搭桥术患者，动物模型有犬、裸鼠及恒河猴。免疫抑制犬模型(4例)为14d短期评估，组织学显示存在巨大免疫反应。裸鼠模型实验分两组，第一组(13例)使用的是单层的1.5 mm内径血管(无内膜)，被移植到动物的腹主动脉上，225d后总通畅率85%，但观察到血管内径增加，提示血管强度需进一步加强。第二组(14例)使用的是包含内膜的双层血管[9个片段，平均抗压强度(3 688±1 865)mmHg]，225d后总通畅率86%。与第一组不同的是血管口径保持稳定，显示该血管有足够的机械强度。镜下显示血管与周围组织融合良好，组织学评估证实血管与自体组织完全融合。长期移植未出现血栓，说明在术后无抗血小板治疗的情况下，此种血管具有良好的抗血栓能力。此外，第180天血管腔内未见内皮细胞定殖，从侧面说明管腔内未种植内皮细胞的移植血管是可以保持通畅的。血管成熟性方面：第90天可见中层存在稀薄的α肌动蛋白阳性的SMC及内膜有融合的内皮细胞。Movat染色，“中层”含有清晰的弹性薄层及大量粘多糖。第180天，中层厚度无改变，弹性层密度增加，黏多糖不可见。这些变化提示血管达到成熟与重建过程的平衡。此过程中残存的可溶性胶原支架在数周内完全降解[21]。为了进一步对该移植血管进行临床相关性及生化环境的评估，学者们采用了免疫抑制灵长目模型恒河猴3只[内径4.2 mm，5个片段，平均抗压强度(3 468±500)mmHg]，1例移植于髂动脉，2例移植于腹主动脉。尽管是异种血管移植，存在轻微的免疫反应，6～8周后所有移植血管被取出，所有血管通畅，未见血管瘤或管腔狭窄，内膜未见内皮细胞增生。组织学分析显示血管重建比裸鼠模型要轻，也许是因为移植时间较短或者采用了免疫抑制，也可能是两种模型本质上的差别。

LifelineTMTEBV作为HD通路的临床研究2007年L’Heureux等[22]报道了6例首批接受LifelineTMTEBV移植的患者，参与患者均为终末期肾病，年龄29～89岁(68±17岁)，每周透析3次。所有患者均为PTFE移植血管失败，该研究应用LifelineTM血管作为动静脉搭桥HD通路。所构建TEBV长20～40 cm，都用于上臂血管通路。早期(3月内)血管通畅，患者未见不良反应。生物机械测试显示LifelineTMgrafts平均强度3 490±892 mmHg(230个片段,25例患者)，高于人大隐静脉(1 599±877 mmHg,7个片段)，并具有可重复性[(3 238±366)mmHg、6个片段vs(3 561±435)mmHg、25个片段][23]。2009年McAllister等[24]的一项队列研究共纳入10例患者，9例成功接受上臂血管移植，1例因为消化道出血退出。1例移植后39d死于无关病因，死亡时移植血管通畅。1例患者移植后第3天出现急性免疫反应并出现血管瘤，可能是因为培养血管的新型牛血清中IgG水平较高所致，因为使用去IgG的牛血清培养的血管的患者未发生免疫反应。有3例前90d失败，低于AVF预期[25,26]；余下5例保持通畅6～20月，总通畅时间为68个患者月；其中1例患者需要手术干预。总体初始通畅率(1月)78%(7/9)，半年通畅率60%(5/8)。通路事件率为0.7/患者年，优于PTFE移植血管[27]。尽管此项研究说明TEBV临床应用于透析血管通路在理论与实践上是可行的，但仍存在局限性：(1)病例数较少，需要更大样本与更长时间的观察；(2)造价高昂[28]，每根移植血管造价≥15 000美元，不太符合临床移植血管的选择标准；(3)患者单独培养血管需要耗时6～9个月，不适用于需要紧急干预者。

脉动生物反应器构建TEBV

脉动生物反应器构建TEBV的方法Niklason等[29]将SMC悬液注入生物可降解聚合物材料聚乙醇酸(PGA)制成管形支架中，细胞贴壁后，用近似大哺乳动物胎儿发育环境，产生脉动流和环流的生物模拟培养系统培育。培育8周中，SMC迁入PGA骨架内，其在PGA降解的同时，分泌胶原等ECM。当ECM与细胞一起形成的肾小管结构替代PGA支架时，管腔内接种EC生物模拟培养系统使培养液在管腔中不断流动(产生一定的剪切力)，并通过脉冲泵的控制使流体产生有节律的脉动波以刺激细胞成熟。该实验显示，脉动培养条件利于SMC迁移、分化表型表达(细胞内肌球蛋白量增多，细胞保持收缩反应，细胞有丝分裂率无增大)及细胞分泌胶原/ECM。体外培养可达到近似体内的细胞密度及胶原含量。在此种物理力学环境和优化培养渣中培养出的血管，其机械力学性能优于先前任何一种TEBV，抗胀裂强度/静水压大于2 000 mmHg，缝合固持强度达90g，胶原含量超过50%。管壁细胞具有良好的分化状态，更新率低。血管对药物作用产生收缩反应。动物自体移植4周，TEBV仍通畅，血液流动良好，异体移植通畅性大于无脉动培养。组织学检查，血管无炎症反应。这一模式首创脉动培养，革新了体外TEBV培育条件。

生物反应器构建组织工程化血管的动物模型研究2011年，Dahl等[30]采用此构建法，以人尸体来源SMC为种子细胞，构建口径3～6 mm的TEBV。得到的胶原纤维基质无需内皮细胞化，经干燥灭活及去抗原性后在狒狒模型上作为动静脉搭桥(内径6 mm 颈动脉-肱静脉)，共手术9例，1例因伤口感染退出，余下8例中有1例术后3月出现栓塞，考虑可能为技术失败。观察6月通畅率为88%(7/8)，未见动脉瘤、血管钙化及内膜增生。异种移植未出现炎症反应，具有良好的生物兼容性及免疫耐受性。检测该血管伸展强度(178±11)g，最大抗静水压强度(3 337±343)mmHg，高于大隐静脉。该血管还可存储于PBS液中4℃可保存12月及以上。

生物反应器构建的TEBV有希望应用于HD通路的制作尽管生物反应器构建TEBV还未进入临床试验，但其具有的某些特点，有望成功用于制作HD通路:(1)有足够的机械稳定性，可事先确定管径大小，且无分支，优于尸体血管。(2)用于制作血管通路时，不必要在管腔内种植内皮细胞(内皮化)。因为血液透析血管通路的口径一般>5 mm，血流量>500 ml/min，这种条件下省去内皮化不会增加凝血的风险，同时能有效降低成本，节省了宝贵的手术时间。如需要用于冠脉搭桥(口径<3 mm)，为减小血管狭窄的风险，也可在已构建好的血管基础上再种植内皮细胞[24，31]，其来源为脂肪组织[32]或外周血[33，34],方便快速，患者只需等待数周乃至数天。(3)使用异体SMC构建血管可不必对每例患者单独进行血管构建，能大量生产进而商业化，利于急诊应用。(4)这种血管的主要成分是灭活的脱细胞基质，因此可以长时间存储，简化运输条件及省去一些质量控制手续。

小结：化学材料被组织工程材料取代是医学发展的一个趋势[35]。我国透析人群总数在逐年扩大，高龄透析患者比例上升，透析时间的延长，对HD血管通路的建立和维护提出了巨大的挑战。对于血管条件不好的患者，采用移植TEBV建立血管通路应该是可行的，而且是必要的。组织工程作为一门新兴的交叉学科，如何更好的服务于临床，服务于患者，是转化医学的基本要求，也是医疗临床、基础工作者共同努力的方向。

1 Allon M.Fistula first:recent progress and ongoing challenges.Am J Kidney Dis,2011,57(1):3-6.

2 Kim DS,Kim SW,Kim JC,et al.Clinical analysis of hemodialysis vascular access:comparision of autogenous arterioveonus fistula & arteriovenous prosthetic graft.Korean J Thorac Cardiovasc Surg,2011,44:25-31.

3 Lacson E Jr,Wang W,Lazarus JM,et al.Change in vascular access and hospitalization risk in long-term hemodialysis patients.Clin J Am Soc Nephrol,2010,5(11):1996-2003.

4 Collins AJ,Foley RN,Herzog C,et al.Excerpts from the US renal data system 2009 annual data report.Am J Kidney Dis,2010,55(1 suppl 1):S1-420,A6-7.

5 Sharp MA,Phillips D,Roberts I,et al.A cautionary case:the SynerGraft vascular prosthesis.Eur J Vasc Endovasc Surg,2004,27(1):42-44.

6 Dohmen P,Liu J,Lembcke A,et al.Reoperation in a Jehovah’s Witness:22 years after aortic allograft reconstruction of the right ventricular outflow tract.Texas Heart Inst J,2003,30(2):146-148.

7 Madden RL,Lipkowitz GS,Browne BJ,et al.A comparison of cryopreserved vein allografts and prosthetic grafts for hemodialysis access.Ann Vasc Surg,2005,19:686-691.

8 Huber TS,Buhler AG,Seeger JM.Evidence-based data for the hemodialysis access surgeon.Semin Dial,2004,17(3):217-223.

9 Perera GB,Mueller MP,Kubaska SM,et al.Superiority of autogenous arteriovenous hemodialysis access:Maintenance of function with fewer secondary interventions.Ann vasc surg,2004,18(1):66-73.

10 Schild A,Perez E,Gillaspie E,et al.Arteriovenous fistulae vs.arteriovenous grafts:a retrospective review of 1,700 consecutive vascular access cases.J Vasc Access,2008,9(4):231-235.

11 Babensee JE.Interaction of dendritic cells with biomaterials.Semin Immunol,2008,20(2):101-108.

12 Engelsman AF,van der Mei HC,Ploeg RJ,et al.The phenomenon of infection with abdominal wall reconstruction.Biomaterials,2007,28(14):2314-2327.

13 Shin’oka T,Imai Y,Ikada Y.Transplantation of a tissue-engineered pulmonary artery.N Engl J Med,2001,344(7):532-533.

14 Shin’oka T,Matsumura G,Hibino N,et al.Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells.J Thorac cardiovasc surg,2005,129(6):1330-1338.

15 McKee JA,Banik SS,Boyer MJ,et al.Human arteries engineered in vitro.EMBO Rep,2003,4(6):633-638.

16 Poh M,Boyer M,Solan A,et al.Blood vessels engineered from human cells.Lancet,2005,365(9477):2122-2124.

17 L’Heureux N,Pquet S,Labbé R,et al.A completely biological tissue-engineered human blood vessel.FASEB J,1998,12(1):47-56.

18 Peck M,Dusserre N,McAllister TN,et al.Tissue engineering by self-assembly.Materials Today,2011,14:218-224.

19 Pauly RR,Passaniti A,Bilato C,et al.Migration of cultured vascular smooth muscle cells through a basement membrane barrier requires type IV collagenase activity and is inhibited by cellular differentiation.Circ Res,1994,75(1):41-54.

20 L’Heureux N,Dusserre N,Konig G,et al.Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization.Nat Med,2006,12(3):361-365.

21 Morimoto N,Saso Y,Tomihata K,et al.Viability and function of autologous and allogeneic fibroblasts seeded in dermal substitutes after implantation.J Surg Res,2005,125(1):56-67.

22 L’Heureux N,McAllister TN,de la Fuente LM.Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization.N Engl J Med,2007,357(14):1451-1453.

23 Konig G,McAllister TN,Dusserre N,et al.Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery.Biomaterials,2009,30(8):1542-1550.

24 McAllister TN,Maruszewski M,Garrido SA,et al.Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft:a multicentre cohort study.Lancet,2009,373(9673):1440-1446.

25 Dember LM,Beck GJ,Allon M,et al.Effect of clopidogrel on early failure of arteriovenous fistulas for hemodialysis:a randomized controlled trial.JAMA,2008,299(18):2164-2171.

26 Gibson KD,Gillen DL,Caps MT,et al.Vascular access survival and incidence of revisions:a comparison of prosthetic grafts,simple autogenous fistulas,and venous transposition fistulas from the United States Renal Data System Dialysis Morbidity and Mortality Study.J Vasc Surg,2001,34(4):694-700.

27 Perera GB,Mueller MP,Kubaska SM,et al.Superiority of autogenous arteriovenous hemodialysis access:maintenance of function with fewer secondary interventions.Ann Vasc Surg,2004,18(1):66-73.

28 McAllister TN,Dusserre N,Maruszewski M,et al.Cell-based therapeutics from an economic perspective:primed for a commercial success or a research sinkhole?Regen Med,2008,3(6):925-937.

29 Niklason LE,Gao J,Abbott WM,et al.Functional arteries grown in vitro.Science,1999,284:489-493.

30 Dahl SL,Kypson AP,Lawson JH,et al.Readily Available Tissue-Engineered Vascular Grafts.Sci Transl Med,2011,3(68):68ra9.

31 Deutsch M,Meinhart J,Zilla P,et al.Long-term experience in autologous in vitro endothelialization of infrainguinal ePTFE grafts.J Vasc Surg,2009,49(2):352-362.

32 Arts CH,Heijnen-Snyder GJ,Joosten PP,et al.a novel method for isolating pure microvascular endothelial cells from subcutaneous fat tissue ideal for direct cell seeding.Lab Invest,2001,81(10):1461-1465.

33 Kalka C,Masuda H,Takahashi T,et al.Transplantation of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for therapeutic neovascularization.Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(7):3422-3427.

34 Hill JM,Zalos G,Halcox JP,et al.Circulating endothelial progenitor cells,vascular function,and cardiovascular risk.N Engl J Med,2003,348(7):593-600.

35 Olson JL,Atala A,Yoo JJ.Tissue Engineering:Current Strategies and Future Directions.Chonnam Med J,2011,47(1):1-13.