乌苯美司对白血病细胞作用的研究进展*

张晓芬，周 丽

(1.泰山医学院附属医院血液内科，山东 泰安 271000)

1 增强免疫功能作用

白血病患者在应用化疗药物清除癌细胞的同时机体免疫力下降，需要上调免疫系统定时定量的监控癌细胞的发生与发展[2]。乌苯美司可作为一种免疫调节药(Immunomnodulators)，能够调节、增强、兴奋和恢复机体的免疫功能[3-5]，通过增强T、B淋巴细胞的功能，使其DNA合成增加，NK细胞的杀伤活力增强,且可使集落刺激因子合成增加,刺激骨髓细胞的再生及分化而发挥作用。

1.1乌苯美司对淋巴细胞活性的影响

乌苯美司(ubenimex)作为一种氨肽酶抑制剂, 除具有多种抗肿瘤活性外还具有免疫激活作用[6]。研究表明乌苯美司对淋巴细胞有促分裂作用，从而发挥增强免疫功能。实验可采用H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)渗入率检测淋巴细胞的增殖功能，沈炜明等[6]报道高浓度乌苯美司(100μg/ml)能刺激促细胞分裂剂(ConA或LPS)对小鼠脾淋巴细胞的促细胞分裂作用，且对B细胞的促分裂作用优于对T细胞的作用。Müller等[7]报道，乌苯美司能提高T、B细胞的3H-TdR渗入。这种促分裂作用可能与氨肽酶调节淋巴细胞生长，参与免疫细胞间的信号传递有关[8]，而乌苯美司作为氨肽酶抑制剂可以抑制对氨肽酶水解相关的细胞因子，从而提高免疫功能。

1.2乌苯美司对NK细胞活性的影响

NK细胞(自然杀伤细胞)是与T、B细胞并列的第三类群淋巴细胞，能够自然杀伤肿瘤细胞，其数目、活性与癌症的发生发展、疾病转归密切相关。多项研究表明乌苯美司通过增强NK细胞的活性而增强机体免疫力，沈炜明等[9]报道小鼠腹腔注射环磷酞胺200 mg/(kg·d) x ld致小鼠NK细胞活性明显降低，若联合乌苯美司，可使NK细胞活性恢复，实验中乌苯美司可诱导IL-2的产生，而IL-2是IFN的刺激因子[10]，初步考虑乌苯美司是通过参与NK-IFN-IL-2免疫调节网的正向调节而提高NK细胞活性。

1.3乌苯美司对细胞因子的影响p

研究表明氨肽酶抑制剂可以促进单核细胞-巨噬细胞(免疫细胞)产生细胞因子和趋化因子。为阐明乌苯美司对外周血单核-巨噬细胞所产生的细胞因子的影响，Lkhagvaa B等[1]从健康志愿者外周血提取的单核细胞置于添加或不加脂多糖(LPS)的培养基中培养，LPS刺激单核细胞产生促炎因子和趋化因子如IL-6、CXCL8/IL-8、CCL3/MIP-1a，实验中用不同浓度的乌苯美司干预，发现50mg/ml的乌苯美司可抑制这些因子的产生和表达，其抑制率分别为71.2%，29.7%，61.0%。另外可检测到IL-10的产生和表达较未用乌苯美司干预时增加，从而提示乌苯美司有抑制促炎因子并刺激抗炎因子生成的作用。

白血病细胞接触血管内皮细胞诱发内皮细胞释放IL-8，IL-8可诱导低水平表达CD13的K562白血病细胞发生凋亡，而高度表达CD13的NB4细胞等白血病细胞不会发生IL-8介导的细胞凋亡。为探讨在各类白血病细胞中膜表面氨肽酶活性与IL-8介导的细胞凋亡之间的关系，Mishima Y等[12]联合应用IL-8、乌苯美司作用于高水平表达CD13的白血病细胞，提示乌苯美司通过抑制氨肽酶水解IL-8、提高IL-8mRNA水平而诱导白血病细胞凋亡。

2 抗白血病作用机制

2.1乌苯美司对白血病细胞抑制增殖、诱导分化的影响

乌苯美司对白血病的疗效已由动物实验和临床试验得到证实。Sakurada等[13]报道乌苯美司对白血病细胞株如HL-60、K562、Raji等有生长抑制作用。国内外临床研究实验报道，羟基脲等化疗药物联合应用乌苯美司对CML血液学完全缓解率得到显著提高，与对照组相比，缩短CML患者达完全缓解的时间并延长慢性期和生存期，降低急变率。欧阳敏等[14]报道采用马利兰与乌苯美司联合治疗ph阳性的CML患者10例，全部达完全血液学缓解，6例达细胞遗传学缓解，且治疗后Ph染色体含量降低。Hirano等[15]研究，氨肽酶抑制剂可以增强维甲酸(ATRA)对NB4细胞的诱导分化作用，这种增强作用与降低氨肽酶(CD13)对诱导分化剂的敏感性相关。

2.2乌苯美司对白血病细胞的促凋亡作用

细胞凋亡 ( apoptosis) ，又叫程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD) ,指细胞在发育和形态建成中，出现的一种由基因控制、形态学特征与坏死截然不同的自主性死亡过程。细胞凋亡一般由细胞外的调节因素与膜表面相应受体结合而启动，经活化的受体又启动胞内第二信号系统，激活核酸内切酶，进而引发细胞凋亡，因此越来越多的学者投入到细胞凋亡的研究中。目前乌苯美司诱导白血病细胞凋亡机制的研究得到一定程度的进展。

2.2.1抑制胺肽酶活性

CD13(氨基肽酶)在许多肿瘤细胞中高度表达[16]，是正常或恶性髓系细胞的表面标志物[17]，可用于对白血病、淋巴瘤的分型及判断预后。因此乌苯美司作为一种氨肽酶抑制剂，对高表达CD13的血液恶性肿瘤细胞可实现靶向治疗的作用，具有广泛的临床应用价值。

2.2.2阻滞细胞周期

根据细胞周期不同时相特点，将其分为G1期、S期、G2期和M期，周期的正常顺序进行主要是由周期蛋白(Cyclin)和周期蛋白依赖性激酶(CDK)的结合和解聚驱动的，在这过程中通过Cyclin随细胞周期不同时相进行合成和降解，CDK有序的磷酸化和去磷酸化来，以及CDI(周期蛋白依赖性激酶抑制因子)时相性变化等来实现。研究报道抑制白血病细胞APN/CD13的表达及酶活性，能够引起白血病细胞的周期阻滞，停滞在G1期，从而抑制白血病细胞的生长，诱导白血病细胞的凋亡[18]，提示乌苯美司作为氨肽酶抑制剂可通过阻止细胞周期发挥促凋亡作用。

2.2.3降低C-myc基因表达

C-myc基因是myc基因家族的重要成员之一，最初是作为一个原致癌基因发现的，活跃于多数肿瘤细胞中。癌基因C-myc在基因转录和细胞周期调节中起重要的"分子开关"作用[19]，能够控制DNA复制，当失控时表现为C-myc高水平表达，引起DNA损伤和不正确的细胞增殖，抑制细胞分化，诱导细胞凋亡的作用也遭到破坏，进而导致癌症的发生[20]。钱学军等[21]报道乌苯美司作用于NB4细胞后RT-PCR检测C-myc mRNA表达水平较对照组减低。

2.2.4抑制MAPK磷酸化

MAPK属于Ser/Thr蛋白激酶，由3类蛋白激酶MAP3K-MAP2K-MAPK组成，在不同的信号转导途径中通过依次磷酸化将上游信号传递至下游应答分子。Sawafuji等[22]报道乌苯美司可通过抑制MAPK磷酸化增强维甲酸对NB4细胞的诱导分化作用，促进凋亡。

3 结 语

白血病的治疗仍以化疗为主，然而长期化疗过程中产生的耐药性及毒副作用是导致化疗失败的主要原因，因此寻找低毒、高效具有抗肿瘤活性的药物成为研究的热点。而乌苯美司作为一种氨肽酶抑制剂，除具有增强调节机体免疫力外，还可有效抑制恶性血液病细胞表面CD13的活性，发挥独特的靶向治疗作用，若在化疗过程中联合应用乌苯美司可增强机体肿瘤细胞对药物敏感性，降低耐药率及副作用，对血液恶性肿瘤的治疗具有重要的临床应用价值。

[1] Wang C, Fan G, Lin M, et al. Development of a liquid chromatography/tandem mass spectrometry assay for the determination of bestain in rate plasma and its application to a pharmacokinetic study[J]. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2007,850(1-2):101-108.

[2] Koebel CM, Vermi W, Swann JB, et al. Adaptive immunity maintains occult cancer in an equilibrium state[J].Nature, 2007, 450(7171):903.

[3] 李炳齐,汪河滨,谷新利.中药复方免疫增强剂中多糖的超声提取及含量测定[J],西北农业学报,2005,14(3):134-136.

[4] 冯胜民,张厚纬.杭州地区抗排异物在器官移植中的应用分析[J].中国新药杂志,2008,17(5):427-429.

[5] 梁竹,何辉,刘召平.我院2000～2004年免疫抑制剂利用分析[J].药学实践杂志,2006,24(1):53-55.

[6] 沈炜明,胡其乐等.乌苯美司对小鼠白细胞介素-2的影响[J].新药与临床,1995,14(4):197-200.

[7] Muller WEG, Zahn RK, Arendes J,et al. Mechanisms of ageing and development[J]. Biochem Pharmacol, 1980,14(1-2):39-48.

[8] Kido,A,Krueger S, Haeckel, C, et al. Inhibitory effect of antisense aminopeptidase N(APN/cd13) cDNA transfection on the invasive potential of osteosareoma cells[J].Clin-ExP-Metastasis, 2003,20(7):585-592.

[9] 沈炜明,强文安,杜敏琼,等,乌苯美司对小鼠脾脏天然杀伤细胞活性的增强作用[J].中国医药工业杂志,1995,26(6):255-257.

[10] Shaw Are, Bleackley RC, Merryweather JP et al. cellular immunology[J]. 1985,91:193.

[11] Lkhagvaa B, Tani K, Sato K, et al. Bestatin, an inhibitor for aminopeptidase, modulates the production of cytokines and chemokines by activated monocytes and macrophages[J]. Cytokine,2008,44(3):386-391.

[12] Mishima Y, Terui Y, et al. Leukemic cell-surface CD13/aminopeptidase N and resistance to apoptosis mediated by endothelial cells[J]. Natl Cancer Inst, 2002,94(13):1020-1028.

[13] Skurada K, Imanura M, Kobayashi M, et al. Inhibitory effect of bestatin on the growth of human leukemic cells[J].Aetanoeol, 2000,29(6):799.

[14] 欧阳敏,刘茂发.Ph染色体与bcr/abl融合基因的检测在CML中的临床意义[J].2001,10(4):224-227.

[15] Hirano T, Kizaki M, Kato K, et al. Enhancement of sensitivity by bestatin of acute promyelocytic leukemia NB4 cells to all-trans retinoic acid[J]. Leuk Res,2002,26(12):1097-103.

[16] Richard A, Ashmun A，Thomas Look. MetalloProtease Activity of CDl3/AminoPePtidase N on the Surface of Human Myeloid Cells[J].Blood，2000，75(2):462-69.

[17] 林茂芳,钱习军.氨肤酶抑制剂对全反式维甲酸诱导人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4细胞分化作用的影响极其机制的初步探讨[J].中国实验血液学杂志,2006,14(3):471-476 .

[18] Schmidt EV. The role of c-myc in regulation of translation initiation[J]. Oncogene,2004,23(18):3217-3219.

[19] Calvisi DF, Conner EA, Ladu S, et al. Activation of the canonical Wnt/beta-catenin pathway confers growth advantage in c-myc/E2F1 transgenic mouse model of liver cancer[J]. J Hepatol,2005,42(6):842-849.

[20] 林茂芳,钱习军. 乌苯美司下调c-myc表达与其增强全反式维甲酸诱导NB4细胞分化作用关系的实验研究[J].中国病理生理杂志,2007,23(8):1527-1530.

[21] Sawafuji K, Miyakawa Y, Weisberg E, et al. Aminopeptidase inhibitors inhibit proliferation and induce apoptosis of k562 and STI571-resistant k562 cell lines through the MAPK and GSK-3beta pathways[J]. Leukemia Lymphoma, 2003,44(11):1987-1996.

[22] Kato M, Azuma H, Akaike M, et al. Aspirin inhabits thrombin aetion on endothelial cells via Up-regulation of aminopeptidase N/CD13 expression。Atheroselerosis[J].2005,183(1):49-55.