口腔癌动物模型建立的研究进展*

倪春晓 李晓光

(1.泰山医学院，山东 泰安 271016； 2.泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安 271000)

口腔癌是目前世界上最常见的十大恶性肿瘤之一，占全身恶性肿瘤的 5%，其中，90%为上皮源性的鳞状细胞癌。近年来口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)的发病率呈上升趋势，发病年龄也趋于年轻化[1-2]。因而建立与人类口腔癌相似的动物模型，有利于探讨口腔癌的病因、发展、浸润和转移。口腔癌动物模型的建立方法目前常用的有化学诱导剂法、肿瘤细胞株接种法或肿瘤组织块移植法、基因突变法等。本文就口腔癌动物模型建立方法的研究进展作一综述。

1 化学诱导剂法

化学试剂诱导发生口腔恶性肿瘤是最常见的一种方法，也比较成熟，半个世纪以来一直被国内外许多学者采用。此类制作方法的优点是：可较好的模仿人类口腔癌的发生过程，能在严格控制各种条件下短时间内复制出大量口腔恶性肿瘤动物模型。缺点是：制作周期长，肿瘤发展缓慢；且所建立的动物模型和自然产生的疾病模型在某些方面还存在一定程度的差异。因此，这类制作方法多用于肿瘤的病因学及预防研究,不利于做肿瘤治疗及进展研究。

1.1实验动物的选择

迄今为止，国内外学者使用的实验动物主要有金黄地鼠、小鼠、大鼠、仓鼠、裸鼠[3]等，其中以金黄地鼠、大鼠、小鼠为常用。

金黄地鼠因为存在特殊的解剖结构颊囊(颊囊被覆角化复层鳞状上皮，对致癌剂敏感，常作为诱癌的部位[4])，被广泛作为诱癌动物。实验性金黄地鼠颊囊癌被认为是一个简单、方便、重复性好、较稳定而又容易建立的口腔粘膜化学致癌动物模型，在癌症的病因、病理、治疗实验中得到广泛应用。用于实验的金黄地鼠最适宜的鼠龄是 5 周，体重一般是60～80 g。大鼠因食性广泛，容易饲养，亦常作为诱癌动物，常用的有Wistar大鼠和 SD 大鼠。用于实验的 Wistar 大鼠一般为 6～8 周鼠龄，体重为150～180 g；SD 大鼠鼠龄为130～150 d，体重为 180～230 g[3]。小鼠性温顺、易捕捉，也可用作诱癌动物，用于实验的小鼠鼠龄约为40 d ，体重为 18～25 g[7-8]。可用来诱导牙龈癌、上腭癌、舌癌等[5]。

1.2致癌剂的选择

应用于口腔恶性肿瘤动物模型诱导的致癌剂分为以下几种：二甲苯蒽(10-dimethyl-1,2-benzanthracene,DMBA)，5-溴脱氧尿苷(5-bromodexyuridine,BrdUrd)，N-氧化-4- 硝基喹啉(4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO)，3-甲基胆蒽(methylcholanthrene,MCA)，拉帕醇(lapachol,LAP)，二氯甲烷(methylene chloride)，碘化钾(potassiumiodide,KE)，磷酸铬(chromic colloidal phosphate,CCP)，其中最常用的是DMBA,其次还有4NQO及MC[6]等。

DMBA是多环芳香烃类致癌物，是直接致癌剂， 对上皮细胞的 DNA 有较强毒性，当一定量的 DMBA 经历一段时间积累作用于黏膜上皮细胞后，DNA 发生突变，细胞发生异常增生，被广泛应用于动物肿瘤模型的建立。DMBA 为黄色粉末，可用液体石蜡或丙酮配制成 0.5%溶液，使用方法是口腔黏膜局部涂抹法或直接注射法。

4NQO 是水溶性喹啉衍生物，是一种很强的水溶性前体致癌剂，属芳香胺杂环化合物。在体内被 4NQO 还原酶代谢为近致癌物 4-羟氨基喹啉-1-氧化物，再进一步代谢为终致癌物 4-乙酰氨基喹啉-1-氧化物(4-AAQO)，4-AAQO以共价键的方式与靶器官细胞 DNA 结合，并破坏染色体的结构,使鼠第 7 号染色体上 H-ras1 基因第 12 位密码子发生 G→A 转换，进一步影响抑癌基因和癌基因表达,最终导致癌发生[7]。4NQO呈淡黄色粉末状，可配置成 0.5%的 4NQO 丙二醇溶液或二甲亚砜液，也可用蒸馏水配成 0.1%溶液，使用方法是用自来水稀释成0.002%浓度放到避光瓶中由动物自由饮用。

MCA为浅黄色细长棱柱体结晶，可溶于二甲基亚砜(DMSO)，溶于苯、甲苯和二甲苯,微溶于戊醇,不溶于水。常用来诱导培养细胞的转化,在实验动物身上诱导纤维肉瘤和皮肤癌。常用使用方法是直接注射法。

1.3实验方法

1.3.1DMBA 或4NQO溶液涂抹法 Siddavaram Nagini 等[8]用0.5%的DMBA 石蜡油溶液涂抹金黄地鼠颊囊，每周 3 次，连续 14 周，所有鼠均诱导出分化良好的鳞癌.邱存平等[9]采用DMBA涂抹金黄地鼠舌粘膜的同时分别使用刺破粘膜和切割诱发肿瘤，每周2次,共 25周；结果成瘤率为95% (38/40),实验动物均经历了上皮异常增生、原位癌、浸润癌和转移癌几个阶段，3只金黄地鼠出现颈淋巴结转移，组织学呈高分化鳞状细胞癌表现。郑金华等[10]采用1%DMBA丙酮液涂抹联合应用舌创伤致 SD 大鼠和金黄地鼠左侧舌癌，共 24 周；结果SD 大鼠和金黄地鼠 3 d 后舌背黏膜左侧缘相继出现溃疡、白斑、肿大；SD大鼠 8 周可见上皮层增生和基底膜细胞的异型性改变，16 周癌变的基底细胞突破基底膜向深层浸润，镜下见癌细胞分化程度差，无角化珠形成，致癌率 76.6%；金黄地鼠 8 周出现黏膜白斑或乳头状突起，继之出现黏膜糜烂，10 周逐渐形成外生性肿块，镜下见癌细胞分化程度高,有角化珠形成，致癌率为 93.3%。Cavalcante DR等[11]用 DMBA 溶液涂抹大鼠舌背，每周3次，连续 20周，成功建立了大鼠舌癌模型。Burns JA等[12]应用DMBA溶液涂抹21只仓鼠的颊囊，结果19只仓鼠成功建立颊囊部的鳞状细胞癌。Hsu WH[13]及Rajkamal G等[14]应用0.5%DMBA溶液涂抹金黄地鼠颊囊，每周3次，共14周，成功建立口腔鳞状细胞癌。段开文等[15]采用 0.5% 4-NQO丙二醇液涂抹27只Wistar大鼠腭中部每周 3次，成功获得大鼠腭粘膜癌变的各期组织。

1.3.24NQO 溶液饮用法 李文荟等[16]采用4NQO溶液饮用法，对20只SD大白鼠舌粘膜进行诱癌实验，至32周时，20只大鼠有14只出现高分化鳞状细胞癌，3只为原位癌，余 3只为轻、中度异常增生。卜冬平等[17]采用0.001%和0.002% 4NQO饮水喂养Balb/c小鼠16～28周，结果显示0.001% 4NQO是诱发小鼠舌癌前病变的理想浓度，0.002%是诱发小鼠舌癌的理想浓度。 陈慧等[18]采用100 μg/ml、50 μg/ml、10 μg/ml的4NQO通过饮水法作用于C57BL/6小鼠，结果可以观察到舌和食管的病变经历了单纯性上皮增生—异常增生—原位癌—浸润性癌这样一个经典的鳞状上皮细胞癌的病变过程。El-Rouby DH等[19]使用4NQO饮水法成功诱导出舌鳞状细胞癌。Zhou G等[20]采用100 μg/ml的4-NQO饮用水喂养CBA小鼠8周，成功建立小鼠口腔癌模型。

1.3.3DMBA 或MCA直接注射法 张宝平等[21]选取60只金黄地鼠采用预设浓度为0.4%,0.3%,0.2%,0.1%的DMBA丙酮注射法建立金黄地鼠颊囊癌模型,结果显示12W时成癌率分别为25%，87%，42%，58%。李怀奇等[22]采用2%DMBA溶液注射入20只大鼠的颌下腺(每只0.05 ml)，在开始实验1周后给予含0.05%苯巴比妥的饲料喂养3个月，结果诱瘤率为22%。马长路等[23]将MCA直接注射于46只SD大鼠颌下腺腺体内,共诱发产生肿瘤34例,其中鳞状细胞癌4例,平滑肌肉瘤30例。

1.3.4DMBA局部植入法 Sumitomo等[24]用DMBA明胶海绵块植入法成功诱发肿瘤，病理证实为鳞癌。曹选平等[25]用含有2%DMBA的明胶海绵块(1 mm×1 mm×1 mm,约含DMBA 1.0 mg)植入大鼠颌下腺体内的方法,对50只SD大白鼠颌下腺进行诱癌实验,共诱发肿瘤21例,均为鳞状细胞癌。

2 肿瘤细胞株接种法或肿瘤组织块移植法

这是80年代初兴起的一种方法，即将活体肿瘤细胞株或肿瘤组织块植入动物体内而建立肿瘤动物模型。此类制作方法的优点是保留了人类口腔癌的部分病理学、生物学特性，可以观察到肿瘤的浸润和转移过程；缺点是需要一定的外科手术技术和无菌条件，每次接种耗费时间较长，实验动物受手术创伤较大，术后感染、创口的粘连、肿瘤坏死率高等。

2.1实验动物的选择 目前该种实验方法常用的动物是小鼠、裸鼠和新西兰大白兔等。用在肿瘤原位移植中的小鼠体重一般为 18～24 g；裸鼠，鼠龄 3～5 周，体重一般为 18～20 g。近年来，许多学者选择应用新西兰大白兔作为实验动物建立口腔癌动物模型，且所建立的动物模型与人类口腔癌相似，而且由于兔体质量相对较大，有利于CT等影像设备成像显示，同鼠类小动物模型相比有无法比拟的优势。用在实验中的新西兰大白兔一般为 2～3 个月龄，体重 1.5～2.0 kg 。

2.2肿瘤细胞系或株的选择 常用的细胞系或株有Tca8113细胞系、AT-84细胞系、SCC Ⅶ细胞系等，近年来许多学者尝试应用VX2细胞株。VX2细胞株是一种得到广泛承认的可移植的肿瘤细胞株,具有诱导时间短、侵袭性强、血供丰富、种植成功率高的特点，且生物学性质稳定，可种植于兔的多个部位建立原位肿瘤动物模型，早期就可发生肝、肺、纵隔等处转移[26]。用VX2肿瘤细胞株建立口腔局部肿瘤模型发展较临床其他疾病研究晚许多，也是近几年来才有学者试着用VX2瘤株植入到兔舌部或颊部等部位来建立动物模型，且初步研究证明所建立的这种兔VX2鳞状细胞癌模型操作简单，成瘤率高，且其在生化学、形态学和生物学行为上与人类鳞状细胞癌具有较高的相似性，而且不会产生特异性的抗体，能较好的体现原位癌的特点。 Jefferis等[27]首先报道了兔舌VX2鳞癌模型的建立。

2.3实验方法

2.3.1人类口腔癌种植于裸鼠 Cui等[28]采用人体鳞癌细胞悬浮液(细胞浓度1×105个/ml)注入鼠咀嚼肌，成功的建立了下颌骨鳞癌浸润动物模型。Qiu等[29]将人舌癌淋巴结转移标本同位移植到裸鼠的舌部，成功建立了舌鳞状细胞癌裸鼠模型。 张燕等[30]选取新鲜的口腔鳞癌手术标本,制备成1 mm3组织块，植入BALB/c nu-nu裸鼠皮下，成瘤率为56%(15/27)。唐瞻贵等[31]将人口腔疣状癌伴灶性鳞癌颈淋巴转移组织,通过组织块皮下接种法建立转移灶模型，成瘤率87.5% (7/8)，且移植瘤具有人疣状口腔癌转移灶组织类似的形态学特征。

2.3.2细胞系注射法 常用细胞系有Tca8113、AT-84、SCC Ⅶ细胞系等。余杨等[32]通过在裸鼠舌体及颊黏膜内注射接种Tca8113细胞，建立移植瘤动物模型；结果13只舌体接种移植瘤裸鼠中，有 3只出现下颌下淋巴结转移，5只出现淋巴结微灶转移，转移率达到61.54%。15 只颊黏膜接种移植瘤裸鼠中，3 只出现下颌下淋巴结转移，3 只出现淋巴结微灶转移，转移率为 40.00%。 姚金光等[33]将舌鳞状细胞癌Tca-8113细胞注射于裸鼠爪垫皮下的方法建立舌鳞状细胞癌淋巴道转移裸鼠模型，成瘤率为67.5%。Takeshi Nomura 等[34]将SCC Ⅶ细胞系注射入C3H/HeN 小鼠的咬肌区域，建立了侵犯颌骨的口腔癌模型。

2.3.3动物瘤株或组织块口腔原位种植 最常用的为VX2细胞株。此类制作方法细分为VX2细胞悬液注射，VX2组织块接种法，VX2瘤组织块悬液注射法[26]。Lin LM等[35]将VX2新鲜实体瘤块种植到8只兔子的左脸颊,造成口腔溃疡，6周后，8只动物均发现低分化SCCs肿瘤生长，无内部器官转移，在8只兔子中的4只发现11个颈部淋巴结转移，平均每只兔子2.75颈部淋巴结，同时还注意到1只动物有下颚骨和牙齿牙髓癌细胞入侵；结果表明，兔VX2诱导兔口腔癌可能是人类口腔黏膜鳞状细胞癌中潜在的癌症模型。Liao GQ等[36]采用VX2组织块移植法建立兔VX2舌鳞癌移植瘤模型，成瘤率为83.3%。田军等[37]采用3种不同移植瘤方法：瘤组织块植入法、改良瘤细胞悬液注入法、瘤细胞悬液注入法，于兔舌侧缘中1/3黏膜下建立稳定的兔VX2舌鳞癌移植瘤模型，成瘤率分别为83.3%，91.7%，33.3%,局部淋巴结转移率分别为71.4%，100.0%，37.5%,肺转移率分别为35.7%，81.3%，0。沈毅等[38]将新西兰白兔20只,随机分为4组,每组5只,分别植入VX2鳞癌瘤块，结果总成瘤率为75%,其中舌缘80%,舌中线区70%,颈淋巴结转移率均70%,舌癌和颈部转移淋巴结均为低分化鳞癌。

3 转基因法

这是 90 年代以来新发展起来的一种实验方法，常用的方法主要有显微注射法、逆转录病毒载体法、胚胎干细胞法、电脉冲法、精子载体导入法等。此类制作方法的优点是：可以从分子水平研究口腔癌的形成过程中各种分子的改变；利用此技术可以精确地失活某些基因或增强某些基因的表达。缺点是：通常有外源基因的引入；转录效率低；在宿主基因组中的行为难以控制；导致基因的完全突变或缺失；有时不能表达或表达混乱以及不能遗传给后代等；且转基因动物的成活率低，易形成多个原发肿瘤且不能形成多个突变和转移等。因此，这种制作方法也不常应用。

4 展望

近年来随着口腔颌面部肿瘤动物模型的制作成功，尤其是兔VX2口腔颌面部肿瘤动物模型的建立获得了较满意的效果，为研究相关肿瘤的生物学行为提供了临床依据。在大型动物模型的研究上具有很高的应用价值，拟用于临床抗癌药物的筛选，最佳化疗方案的选择，一些缓释药物在口腔肿瘤治疗中的应用及放化疗结合治疗在颌面部转移癌的疗效机制。随着认识的不断深入，兔VX2口腔颌面部肿瘤模型将会被应用于更多的领域。

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