新疆石河子地区酵母菌的生物多样性及系统发育研究

陈 杰，赵雨薇，倪永清，郑晓吉，史学伟*

（1.石河子大学食品学院，新疆 石河子 832000；2.新疆张裕巴保男爵酒庄有限公司，新疆 石河子 832000）

酵母菌是自然界中分布较广的真菌，因其用途广泛而引起高度关注。近年来国内对母菌的多样性研究已涉及到云南的热带雨林、秦岭地区以及天山极地冻土等[1-3]。西班牙、匈牙利、葡萄牙、意大利和美国伊利湖等国家和地区对葡萄及葡萄园中酵母菌的多样性已经展开了大量的研究[4]。

酵母菌是葡萄酒品质的灵魂，对于葡萄酒的香气、色泽、感官质量和风格的影响至关重要，利用不同菌种发酵而生产出的葡萄酒，其酒质和风味大不一样。目前，我国在葡萄酒酵母菌的研究和利用等方面还处在起步阶段，生产葡萄酒所用的酵母菌种大部分依赖于进口，而用单一菌种接种的纯种发酵会使得葡萄酒失去其特有的香气和风味[5]。所以对于酵母菌的多样性和种质的研究，以及及时解决单一菌种的纯种发酵的问题将是以后我国酵母菌研究的重点，并且使用地方的特色菌种来接种发酵或者与其他接种物混合进行发酵，生产出具有地方特色的葡萄酒将会是葡萄酒行业未来的发展趋势[6-7]。

新疆地区具有独特的气候和特殊的地理条件，已经成为我国优质葡萄酒生产最具竞争力的地区之一。石河子市属中温带大陆性干旱半干旱的气候，冬季严寒，夏季酷热，日照充足，干燥少雨，蒸发量大，降水少，温差较悬殊。

本研究在新疆石河子地区采集菌株，分离纯化后，对可培养酵母菌DNA提取后，用26SrDNA D1/D2和ITS区序列扩增及检测，根据同源性序列来对待测酵母进行分类，并构建系统发育树，进行生物多样性分析。初步探明我国新疆地区葡萄酿酒酵母菌的种质多样性及分类地位，为今后葡萄酿酒酵母菌筛选和育种工作提供宝贵的种质资源和理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器和试剂

用于PCR扩增的全套试剂及扩增引物均购自于TaKaRa公司，相关耐性试验所用试剂均购自于天津市巴斯夫化学试剂厂，高速冷冻离心机为Eppendorf公司5810R型，PCR仪为Techne公司TC-512型，凝胶成像系统为BioRad公司Gel DOCXR型，水平电泳仪为美国BioRad公司PowerPac Universal型。

1.1.2 培养基

YPD（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）培养基，121℃灭菌20min。

1.2 样品采集

2010年9月23日采取的葡萄果实及葡萄园土样（采样地点：新疆石河子中信葡萄酒业有限公司葡萄试验园）。

1.3 菌株的分离与纯化

菌株分离纯化采用YPD培养基。

菌株分离的方法：将成熟的果粒破碎、带皮进行自然发酵。待发酵启动后，每日取lmL发酵液，以不同梯度稀释够涂布在YPD培养基上，在28℃培养48h后，挑取单个菌落，经多次平板划线纯化，获得纯培养物（菌株）。纯化后的菌株在斜面上进行保存，并存于-20℃冰箱备用[8-9]。

1.4 形态学的鉴定

酵母菌的常规鉴定方法依据《酵母的特征及鉴定手册》和《微生物分类学》，试验方法参照《微生物学试验技术》。

1.4.1 显微特征

①细胞形态特征：椭圆形、球形、卵球形、倒卵形、柱状、棒状、针形、杆状、长杆状、螺旋形、三角形、新月形或其他形状；

②细胞为单生、对生或群生；

③繁殖方式：单端芽殖、多边芽殖，两端芽殖或裂殖。

1.4.2 固体宏观特征

将活化好的酵母菌株接种在新鲜的YPD平板，在25℃培养1d～7d，观察并记录：

①菌落颜色：乳白色、奶油色，橙色、红色、黄色或粉红、玫红；

②菌落质地：奶酪状，粘稠，松脆或坚韧；

③菌落表面特征：光滑或粗糙、有光泽或暗淡、皱褶、条纹、有突起；

④菌落边缘：平滑（全缘）、裂叶状、、蚀刻状、波浪状、须状或根状；

⑤隆起：菌落平坦或隆起。

1.5 26SrDNA基因PCR扩增和系统进化分析

1.5.1 DNA的提取

用接种环挑取少量供试酵母菌种，悬浮于100μL裂解液（100mmol/LTris，30mmol/LEDTA，0.5%SDS，pH值为8.0）中，在100℃水浴15min，冷却之后加入100μL 2.5mol/L醋酸钾（pH值为7.5），混匀后，置于冰中1h，10000r/min离心10min，取上层清液，加入等体积的氯仿-异戊醇（24:1），剧烈震荡后，10000r/min离心10min，取上清液，用等体积的氯仿异戊醇重复处理1次，加入相等体积预冷后的异丙醇，混匀后在-20℃静置15min，并以13000r/min离心15min，沉淀用100μL 70%vol和无水乙醇分别各洗涤1次，真空抽干后加入50μL无菌水，溶解后在-20℃保藏备用[10]。

1.5.2 PCR扩增与测序

使用引物NL1：5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAA AAG-3′和NL4：5′-GGTCCGTGTTTCAAG-3′PCR反应体系总体积为50μL，每管中加入10×PCR buffer（Taq buffer with KCl）5μL；25mmol/L的MgCl26μL；10μmol/L引物各2.5μL：10mmol/L dNTPs1μL；Taq酶2.0U，模板DNA 1μL；加双蒸水至50μL。PCR循环为95℃、5min，95℃、1min，52℃、2min，72℃、1min，循环次数为35次，72℃延伸10min[11]。

1.5.3 PCR扩增产物的测序

PCR产物首先用EZ-10 column PCR Product Purification kit（BIO BASIC INC，Canada）进行纯化后，在自动测序仪上进行测序。将测序结果提交到GenBank数据库中，利用BLAST进行相关序列的搜索查询，并与GenBank数据库中现有的近缘菌株的序列进行比较，从数据库获得相关属、种的26SrDNA序列，建立系统发育树。下载有关的酵母菌菌种的26Sr DNA D1/D2区序列，将所测得的序列采用CLUSTAL X 1.81软件对齐序列[12]，采用邻接法neighborjoining method计算进化距离[13]，用MEGA v.4.0[14]软件分析进化树分支模式的稳定性，采用bootstrap法，重复次数为1000，构建进化树。

2 结果分析

2.1 形态学特征

以下18个典型菌株分别来自2010年09月23日采样所得葡萄品种：HES（赫尔松）、DBS（大白桑）、JX（京秀）、MGX（玫瑰香）、BXJ（白香蕉）、MXS-2（马西斯）、JLN-2（佳丽酿）、HBKT（红巴克特）、CXZ（赤霞株）、QHWE-4（齐哈维尔）、BLS-2（布列沙）、HZMT（黑扎马特）、HQLM-2（黑齐良母）、ZZ-3（杂株）、SFR-3（赛芙蓉）、JLWSM-1（捷莱乌苏姆）、XMO（西米奥）、BYM（白玉覔）、WDLT（沃德里特）。按照菌落形态（形状、大小、高度、颜色、湿润、光泽、透明度、边缘、表面形态）和细胞形态（圆形、椭圆形、柠檬形、半月形细胞，出芽或裂殖等）初步分为11类，见表1。

表1 酵母菌株的分类Table 1 Classification of yeast

2.2 酵母菌的DNA提取

采用酵母菌DNA微量提取法从纯化后的酵母菌株中提取基因组DNA，其纯度、浓度和完整性能满足PCR扩增反应和测序要求。

2.3 26SrDNA D1/D2区扩增

扩增产物经电泳检测片段在500bp～750bp之间，符合酵母菌26SrDNA D1/D2区理论预期值（约为600bp），如图1。

2.4 基于26SrDNA基因序列的酵母菌株系统发育分析

将26株酵母菌株所获得的26SrDNA D1/D2区域序列提交NCBI，通过Blast工具在GenBank数据库中与已发表的26SrDNA D1/D2区域序列进行同源性比较（表2），构建系统发育树（图2），在基于26SrDNA D1/D2区域序列分析绘制的系统树上，相同的种被归在一个主分枝内，表明其具有较近的亲缘性，而不同的种却在于不同的亚分枝上，显示其在D1/D2区域序列上具有明显区别。

图1 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测图Fig.1 Agarose jel electrophoresis detection result of PCR amplification product

图2 基于26S rDNA 序列的26株酵母菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of the 26 yeast strains based on partial 26S rDNA sequences

表2 分离菌株依据26SrDNA D1/D2 序列鉴定结果Table 2 Identification of the yeast strains based on sequence analysis of the 26S rDNAD1/D2

3 讨论

本研究中，在新疆石河子地区采集野生酵母菌84株，通过细胞核菌落形态及26SrDNAD1/D2区域序列的测定等方法，对所分离的菌株进行系统的分类及鉴定研究。得到以下结论：

（1）鉴定结果发现所有菌株属于6个属，分别为：假丝酵母属（Candida）、Meyerozyma属、红酵母属（Rhodotorula）、孢汉逊属（Hanseniaspora）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和毕赤酵母属（Pichia），共有10个种，其中包括6个疑似种。

（2）新疆拥有独特的地理环境和气候，孕育出很多独特的动植物和微生物。本研究中发现了6株与GenBank已有模式菌株序列同源率低的酵母菌分别是Y2与Galactomyces geotrichumJN083822.1的同源率为98%，Y3与RhodotorulamucilaginosaGU373744.1的同源率为97%，Y4与MeyerozymaguilliermondiiHM988720.1的同源率为98%，Y5与Candida amapaeEU057556.1的同源率为98%，Y6和Y7与HanseniasporauvarumGU080043.1、HM988683.1的同源率为98%和97%等。根据Kurtzman酵母种类的划分依据，同源相似率低于99%的，不能划为同一个种，因此对于这些待鉴定的菌株可以初步认定其是一个新种，有待进一步的形态、生殖方式及生理生化鉴定结果的考证。

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