生物制麦中白地霉的筛选及其特性的研究

彭 涛 ，刘 琦，王千存，张怀予，路宏科，马文锦，陈兴叶，殷 欣

（1.甘肃省轻工研究院，甘肃 兰州 730000；2.甘肃农业大学，甘肃 兰州 730070）

甘啤3号是甘肃省啤酒酿造专用大麦品种，在工业生产上表现出较好的制麦品质，但高海拔种植区的大麦仍存在发芽率较低、溶解性能较差等问题[1]。近年来研究发现，制麦过程中添加一些有益微生物菌株（即生物制麦技术）可改善麦芽的溶解性，提高成品麦芽品质及安全性。

用于生物制麦的有益微生物主要有白地霉（Geotrichum candidum）、乳酸菌（Lactic acid bacteria）和根霉（Rhizopus）等。特别是白地霉培养物，是绿麦芽及焙燥麦芽中自然菌群组成菌种之一，毒理学研究表明其安全、无毒素遗传性[2]。其生长过程中分泌的多种水解酶可促进大麦胚乳细胞的溶解，而且能有效地抑制麦芽中真菌毒素的产生，大大提高麦芽的安全性[3]。

本研究以甘啤3号大麦为原料，从中筛选出产β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶和糖化酶活性较高的白地霉菌株，并对其生长特性进行研究，有利于今后进一步将筛选得到的白地霉应用到生物制麦过程中，以考察通过白地霉改善成品麦芽综合品质的效果，为生物制麦工艺的优化提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株分离源

新鲜浅色甘啤3号大麦，其理化指标为水分15.3%、千粒重32.9g、蛋白质10.8%、发芽率65%，贮存于4℃冰箱中备用。

1.1.2 培养基

麦芽汁琼脂培养基；麦芽汁液体培养基；PDA培养基；5°P麦汁培养基；分解脂肪培养基（果罗德科瓦培养基）。

1.1.3 仪器

恒温鼔风干燥箱；pH计；电子天平；7200型分光光度计；恒温水浴锅；PB203-N型分析天平；培养箱；显微镜；高压灭菌锅。

1.2 试验方法

1.2.1 白地霉筛选分离

（1）采样

无菌条件下选取100粒完整大麦于培养基中，28℃培养24h，定期观察培养过程并记录，选择生霉效果较好的大麦平板，备用。

（2）增殖培养

将上述菌种物接种于麦芽汁液体培养基，28℃恒温箱中培养24h。

（3）平板分离

将增殖培养后的菌种进行适当稀释，涂布麦芽汁琼脂平板，置于28℃恒温培养箱中培养，定期观察并记录。

（4）初筛

挑取经二次平板分离的菌株，进行麦芽汁琼脂培养基划线培养，每株划线3个平皿，保留生长能力较强的菌株。

（5）复筛

将初筛后的菌株再次接种于麦芽汁琼脂培养基，观察其生长能力，保留生长能力较强的菌株。

1.2.2 酶活测定

取250mL三角瓶6个，每瓶装50mL 4g/100mL麦芽粉悬浮液培养基，121℃灭菌20min，冷却至室温。每个三角瓶接种菌株孢子悬浮液1mL，168r/min、28℃恒温振荡培养，从第2d起，每天取一瓶发酵液，3000r/min离心10min。取上清液，适当稀释后测定酶活[4]。

（1）β-葡聚糖酶[5]：在50℃、pH 5.0条件下，每分钟水解β-葡聚糖产生1μmol葡萄糖的酶量定义为一个酶活单位。

（2）木聚糖酶[6]：在50℃、pH 4.8条件下，每分钟水解木聚糖产生1μmol木糖的酶量定义为一个酶活单位。

（3）纤维素酶[7]：在50℃、pH 6.0条件下，每分钟分解羧甲基纤维素生成1μg葡萄糖的酶量定义为一个酶活单位。

（4）糖化酶[8]：在40℃、pH4.6条件下，每分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量定义为一个酶活力单位。

1.2.3 菌种鉴定与保藏

（1）菌种鉴定：对筛选得到的2株生长能力较强、产酶活性指标较高的菌株进行鉴定：

细胞形态、菌落形态观察、糖类同化试验、碳源同化试验、氮源同化试验、水解蛋白、分解杨梅苷测定及分解脂肪试验：均参照《真菌鉴定手册》从梗孢科地霉属白地霉鉴定方法[9]。

（2）菌种保藏：将分离得到的菌株接种于麦芽汁斜面，置于28℃恒温箱中培养24h后于4℃冰箱中备用[10]。

1.2.4 菌株GQG28生长特性的研究

（1）最适生长温度测定：将菌株GQG28种子接入麦芽汁液体培养基中，分别在10℃～37℃不同温度恒温振荡培养（150r/min）10h，于波长660nm处测定培养液OD值，依据OD值大小确定其最适生长温度。

（2）最低和最高生长温度测定：将菌株GQG28种子接入麦芽汁液体培养基中，于5℃～10℃的低温和34℃～38℃的高温150r/min恒温振荡培养8d，观察有无菌体生长[11]。

（3）最适生长pH值测定：将菌株GQG28种子分别接入pH值3～9的不同麦芽汁液体培养基中，于最适生长温度条件下，150r/min振荡培养10h，于波长660nm处测定培养液OD值，依据OD值大小确定其最适生长pH值。

（4）最低和最高生长pH值测定：将菌株GQG28种子液分别接入pH值为1～11的麦芽汁液体培养基中，于最适生长温度条件下，150r/min振荡培养8d，观察有无菌生长[12]。

（5）生长曲线的测定：将菌株GQG28种子液以2%接入pH 5.4的麦芽汁液体培养基中，于最适生长温度条件下，150r/min振荡培养，每隔2h用血球计数板计数法测定麦芽汁中的总菌数，并绘制生长曲线[13]。

2 结果与分析

2.1 菌种分离与鉴定

2.1.1 菌种筛选分离

（1）菌种筛选

培养期间观察得到4个大麦样品具有较强的生霉能力，结果见图1。

图1 菌种筛选结果Fig.1 The results of screening strains from barley

（2）平板分离

平板分离结果见图2。

图2 平板分离结果Fig.2 The result of the flat-panel separation

（3）增殖培养

平板分离后的菌株经过增殖培养后出现菌落，见图3。

（4）纯种分离

经过二次平板分离、初筛、复筛等步骤，共筛选出2株优良菌株GQG28-1和GQG28-2，菌落形态见图4。

图3 菌株增殖培养结果Fig.3 The results of strains proliferation

图4 纯种分离结果Fig.4 The result of primary isolation

2.1.2 产酶情况

测定培养第2d～8d的发酵液相关的酶活，结果见图5，最终筛选出GQG28-1、GQG28-2菌株水解酶活性见表1。

图5 GQG28产4种酶活性变化曲线Fig.5 Change curves of activity of four kinds of enzyme produced by GQG28

表1 GQG28 菌株4 种酶活性Table 1 Four enzyme activities of produced by GQG28（U/mL）

由图5可以看出，在培养第2d～7d时，β-葡聚糖酶、木聚糖酶、酶活随培养时间的延长而增大，在培养第5d时各酶活达到最大值，β-葡聚糖酶酶活为7.3U/mL，木聚糖酶酶活为9.5U/mL，纤维素酶酶活为8.8 U/mL，糖化酶酶活为16.0，之后酶活呈下降趋势。

2.1.3 菌种鉴定及保藏

（1）细胞形态

对筛选得到的2株菌种GQG28-1和GQG28-2细胞形态观察，见图6。

图6 GQG28-1（左，100×）和GQG28-2（右，100×）显微照片Fig.6 The micrographs of GQG28-1 (left，100×)and GQG28-2(right，100×)

由图6可观察到，分离所得菌株的菌落形态，GQG28-1：菌丝宽4.5μm～5.5μm，裂殖，节孢子单个、成双或成链，椭圆或圆形，分枝及曲弯少，圆头；GQG28-2：细胞分布均匀，菌丝宽4.5μm～6.9μm，裂殖，椭圆或圆形，分枝及曲弯少，圆头，有横膈膜，节孢子单个或连接成链。

（2）菌落特征

筛选得到的2株菌种GQG28-1和GQG28-2菌落特征见图7。

图7 GQG28-1（左）和GQG28-2（右）的菌落形态Fig.7 The colony morphology of GQG28-1 (left) and GQG28-2 (right)

由图7观察可知，GQG28-1：菌落直径为62mm，菌落呈白色、绒毛状、扁平、均匀，放射线中心有突起；GQG28-2：菌落直径为59mm，菌落呈白色、绒毛状、扁平、均匀，放射线中心有突起。

（3）糖类同化

糖类同化测定结果见表2。

（4）醇类同化

醇类同化结果见表3。

（5）氮源同化

氮源同化结果见表4。

由表5可知，菌株GQG28-1、GQG28-2均不能分解杨梅苷、均能分解脂肪。

表2 糖类同化结果Table 2 The results of sugars assimilation

表3 同化醇类结果Table 3 The results of alcohols assimilation

表4 同化氮源结果Table 4 The results of nitrogen assimilation

表5 其它生理试验结果汇总表Table 5 Summary of other physiological properties

根据《真菌鉴定手册》综合以上鉴定结果可以鉴定得出从甘啤3号大麦中筛选分离得到的2菌株是白地霉，分别为白地霉GQG28-1和白地霉GQG28-2。

2.1.4 生长特性的研究

（1）最适生长温度

白地霉GQG28的生长温度曲线见图8。

图8 温度对白地霉GQG28生长的影响Fig.8 The effects on temperature on growth of Geotrichum candidum Link GQG28

由图8可以看出，随生长温度的升高OD值增大，于25℃时达到最大值，故白地霉GQG28的最适生长温度为25℃，在15℃～35℃温度范围内生长良好。

（2）最低和最高生长温度

分别于4℃～10℃的低温和32℃～38℃的高温下恒温振荡培养8d，考察菌体生长情况，试验结果见表6。

表6 最低和最高生长温度Table 6 The minimum and maximum temperature for growth

由表6可见，白地霉GQG28的最低生长温度为5℃；最高生长温度为37℃。

（3）最适生长pH值

根据试验数据做出白地霉GQG28的生长pH曲线图，见图9。

图9 pH值对白地霉GQG28生长的影响Fig.9 The effect of pH value on growth of Geotrichum candidum Link GQG28

由图9可以看出，白地霉GQG28生长适宜pH值范围较宽，为4.4～6.8，其最适生长pH值为5.6。pH值低于4.4或高于6.8对其生长影响明显。

（4）最低和最高生长pH值

将白地霉GQG28种子液分别接入pH从1～11的麦芽汁液体培养基中，于25℃培养8d，观察有无菌生长。该酵母菌在1.4～2.0的低pH值和9～10的高pH值麦芽汁中的生长情况见表7。

表7 最低和最高生长pH 值Table 7 The minimum and maximum pH value for growth

由表7可以看出，GQG28在麦芽汁中的最低生长pH值为3.2，最高生长pH值为11.0。故该菌种的生长pH值范围较宽，并对酸性环境有较强的耐受性。

（5）生长曲线的绘制

将酵母菌Kloeckerasp.4-18种子液以2%接入pH 5.4的麦芽汁液体培养基中，于26℃、150r/min振荡恒温培养，每隔2h用血球计数板计数法测定麦芽汁中的总菌数。根据实验数据做出该菌种的生长曲线图，见图10。

图10 白地霉GQG28的生长曲线Fig.10 The growth curve of Geotrichum candidum Link GQG28

由图10可以看出，该菌株在前2h内细胞数量增长不明显，但细胞体积明显增大，属于接种迟滞期；当培养到2h～14h时，视野内单个存在的细胞较多，细胞数以几何级数增长，这一阶段属于对数生长期；培养到14h后菌量达到稳定（约为7.8×108个/mL），并在14h～40h内总菌数基本保持恒定，这一阶段为恒定期。

2.1.5 白地霉制麦应用

将分离筛选出的白地霉GQG28菌株添加到制麦过程中，在最优制麦条件下所制备的麦芽综合指标为206.15，所制麦芽糖化力为308.5WK、α-氨基酸态氮为186mg/100g、浸出物相对质量分数为87.1%，均高于QB/T1686-2008[14]行业标准，与GB 2761-2011：食品安全国家标准[15]相比均未检出真菌毒素，本研究利用白地霉制麦可以得到品质较高的大麦产品。

3 结论

3.1 从甘啤3号大麦中分离筛选出白地霉菌株，对白地霉所产生的4种主要水解酶进行动态测定及分析，筛选出2株产酶活性较高的白地霉菌株GQG28-1、GQG28-2。

3.2 对筛选得到的白地霉菌株的生长性能进行研究，得到白地霉GQG28-1、GQG28-2的最适生长温度是25℃、最适生长范围是5℃～37℃、最适生长pH值为5.6、最适生长pH值范围是3.2～11。

3.3 利用筛选的白地霉制得麦芽综合指标为206.15，所制麦芽糖化力为308.5WK、α-氨基酸态氮为186mg/100g、浸出物相对质量分数为87.1%，均高于QB/T1686-2008[14]行业标准，有效提高了麦芽的综合品质。

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[14]QB/Tl686-2008中华人民共和国轻工行业标准：啤酒麦芽[S].

[15]GB2761-2011：食品安全国家标准-食品中真菌毒素限量[S].