RNA沉默——植物基因组免疫的安全防线

董丽，郭惠珊

中国科学院微生物研究所 植物基因组学国家重点实验室，北京 100101

2006年，美国马萨诸塞大学医学院的Craig C. Mello和斯坦福大学医学院的Andrew Z. Fire因在RNA干扰 (RNA interference，RNAi) 研究领域中的杰出贡献而获得诺贝尔生理学或医学奖。这一事件确立了RNA干扰在真核生物基因表达调控网络中的主导地位。RNA干扰，又称RNA沉默 (RNA silencing)，是一种具有核苷酸序列特异性的，能够导致RNA降解，蛋白翻译抑制，DNA甲基化，以及异染色质形成的表观遗传学效应。RNA沉默现象广泛存在于植物、真菌、涡虫、锥虫、果蝇、大鼠、人等真核生物中。自1990年人类发现RNA沉默现象至今，20多年的探索使植物RNA沉默的理论体系日臻成熟和完善。

1 转录后基因沉默 (Post-transcriptional gene silencing，PTGS)

1.1 RNA沉默的发现

RNA沉默的发现最早可以追溯到1990年。Jorgensen等向矮牵牛中导入粉红色素合成相关基因，预期产生颜色更深的紫色牵牛花，结果发现许多花朵的颜色变成白色或花白色。分析表明：导入的基因与内源粉红色素基因同时被沉默，所以被称为共抑制 (Co-suppression)[1]。这一现象与真菌中的压制 (Quelling)[2]和动物中的RNA干扰 (RNA interference，RNAi)[3]类似，都是以靶标 mRNA的降解为特征，所以又被称为转录后基因沉默 (Post-transcriptional gene silencing，PTGS)。植物中的 PTGS主要过程如下：外源转基因mRNA在一种依赖于RNA的RNA聚合酶 RDR6 (RNA DEPENDENT RNA POLIMERASE6) 的作用下形成双链 RNA (dsRNA)，再由一种 RNA酶 III蛋白——Dicer或Dicer-like (DCL，植物中以DCL4为主) 切割，产生21 nt小干扰RNA (Small interference RNA，siRNA)，siRNA 进入含有Argonaut 蛋白 (AGO)的 RISC 复 合 体 (RNA-induced silencing complex)[4-5]，介导与 dsRNA 有序列相似性的mRNA的降解[4,6-7]。之后，RDR6又以siRNA为引物，外源mRNA为模板，合成新的dsRNA，在 DCL作用下产生更多的次级 siRNA；次级siRNA的再循环使沉默信号得以扩增，在宿主中产生系统性的沉默。

1.2 内源PTGS途径

外源RNA诱导RNAi的发现促使人们寻找内源性RNAi的存在。第一个内源小RNA——线虫lin4，是在1993年发现的[8]；时隔7年，线虫中另一个长度为21 nt的let7 RNA被发现[9]；此后，科研工作者们相继在线虫、Hela细胞、果蝇、拟南芥等许多真核模式生物和细胞中找到了数百种相似的小分子 RNA，并将其称为 miRNA (microRNA)。这些miRNA在各种生物中对靶标RNA的调节功能也很保守[10]。miRNA，一般长度为21~22 nt，是由非编码RNA折叠所形成的、短的、不完全配对的茎环结构经DCL1切割后产生的，小RNA进入AGO1复合体，介导mRNA的降解、翻译后水平的调控[11-13]。通过 miRNA途径，生物体能够动态的调节编码基因的表达水平，以适应不同发育时期和应对外界环境刺激的需要。

植物体内还存在另外一种参与 PTGS的小RNA——反式作用siRNA (Trans-acting siRNA，ta-siRNA)。ta-siRNA途径中的主要环节就是次级siRNA的生成[14]。ta-siRNA的前体是一类来源于TAS (ta-siRNA transcript) 基因的非编码转录本。ta-siRNA的产生需要miRNA的参与，miRNA介导的 TAS基因裂解之后，部分残留的转录本被RDR6转化为dsRNA。dsRNA经 DCL4切割产生ta-siRNA，ta-siRNA介导其他靶标基因，而非TAS基因的降解，故此被称为反式siRNA[15-18]。

nat-siRNA (Natural antisense transcripts siRNA) 途径也是植物内源PTGS途径的一个重要组成部分。拟南芥基因组编码2 000多个自然的顺-反义基因对，这些内源的顺-反义基因转录自不同的DNA链，各自的转录本在3¢末端互补。通常情况下，其中一个基因是组成型表达的，另一个基因仅在特定胁迫条件下被诱导表达，二者形成dsRNA。dsRNA作为DCL的底物，被切割成21~24 nt nat-siRNA。nat-siRNA靶向降解顺-反义基因的一个转录本，裂解的RNA分子又借助于RDR6和SGS3 (SUPPRESSOR OF GENE SILENCING 3) 的功能被转化成 dsRNA。然后RDR6/SGS3合成的dsRNA分子被DCL处理成nat-siRNA，进而被用于介导同源 mRNA的沉默[19]。目前的研究结果表明：DCL1、DCL2、DCL4可能在不同的基因对调控中发挥各自的作用[20-22]。

1.3 RNAi技术

随着PTGS途径研究的深入，RNAi技术应运而生。RNAi技术就是利用人工方法向宿主中引入沉默诱导因子，达到降解靶基因转录本的目的。常用的方法有很多，如将体外合成的siRNA，或包含其序列的dsRNA，用注射等方法导入宿主细胞中；或者，在宿主体内表达与目的基因相关的 miRNA的前体序列或反向重复RNA (Invert repeat RNA，IR-RNA)，诱导靶基因mRNA降解。再有，研究发现植物病毒侵染会诱导基因沉默(Virus induced gene silencing，VIGS)。利用VIGS原理，将目的基因与病毒载体重组，用以侵染植物也能诱导靶标基因的沉默。IR-RNA法稳定、易行；病毒侵染法高效、周期短。因此，二者经常被用于基因敲除和RNA沉默机制的研究中。

2 转录基因沉默

2.1 植物内源RdDM途径

除了PTGS，植物体内还存在一种与小RNA相关的转录基因沉默 (Transcriptional gene silencing，TGS)[23-25]。由于这里的TGS与DNA甲基化相关，因此相应的机制被定义为RNA介导 的 DNA 甲 基 化 (RNA-directed DNA methylation，RdDM)[26]。RdDM途径是植物特有的维持基因组稳定性的机制，其靶点主要是转座子、重复序列和编码短RNA的基因间区[27]。利用遗传学和生物化学方法，人们已经分离出很多参与RdDM途径的调控元件。这些元件在以下3个方面的一个或多个点上行使功能：hc-siRNA (Heterochromatic siRNA) 的合成；脚手架 RNA (Scaffold RNA) 的合成；参与siRNA和新生脚手架 RNA互补配对的效应复合体的排布以招募DNA甲基化酶。

siRNA (以24 nt为主)的合成需要Pol IV (RNA polymerase IV)、RDR2和DCL3的参与[28-32]。而脚手架RNA是由RNA聚合酶Pol V或者Pol II合成的[33-37]。与Pol V相比，Pol II倾向于合成基因间区低拷贝重复位点相关的脚手架RNA[37]。不同的RNA聚合酶在RdDM过程中协同作用。Pol II合成的脚手架转录本可能有助于招募Pol IV和Pol V到RdDM靶点，分别促进siRNA的生成或DNA甲基化。Pol V合成脚手架 RNA的过程需要染色质调节蛋白DRD1 (DEFECTIVE IN RNA-DIRECTED DNA METHYLATION 1)、染色质铰链结构域蛋白DMS3 (DEFECTIVE MERISTEM SILENCING3) 和 RDM1 (RNA-DIRECTED DNA METHYLATION1) 的参与[36-40]；而Pol II合成脚手架 RNA需要 DRD1，但不需要DMS3[37]，是否需要RDM1还未经查考。siRNA和脚手架RNA配对及DNA甲基化酶的招募过程则由AGO4、AGO6或者AGO9、DRD1、Pol V、DMS3 (DEFECTIVE IN MERISTEM SILENCING3)、RDM1和 DNA甲基转移酶DRM2 (DOMAINS REARRANGED METHYLASE2) 负责[27,38-39,41-45]。细胞学分析结果表明：植物中RdDM途径对于靶位点的沉默调控具有时空分布的特点。高度重复序列主要聚集于核仁周边区，被Pol V介导的RdDM沉默。而对于基因间低拷贝位点，则有两种情况：分布在核仁周边区的，被依赖于 Pol V的RdDM 沉默；散布于核质中的，则成为依赖于Pol II的RdDM沉默靶点[36-37,46]。

目前在拟南芥中还发现2个反向重复序列与通常用于RNAi的转基因结构极其相似，有对应的靶点，均能产生21~24 nt的siRNA。其中至少IR71的siRNA能被招募到AGO复合体中介导自身和靶基因的PTGS和RdDM。嫁接实验表明，这些siRNA能够进行长距离运输，并能在目标组织中介导RdDM[47]。

2.2 转基因诱导的TGS

尽管 RdDM途径是植物特有的维持基因组稳定性的机制，但该途径最早是在转基因诱导沉默实验中被发现的[23-25]。利用与启动子同源的序列构建IR转基因载体，在植物体内转录，其产物在细胞核里被加工成24 nt siRNA后，能够介导相应区域的DNA甲基化，从而抑制靶基因转录。植物中，诱导转基因和编码蛋白的内源基因的TGS效率有很大差别[48]。植物基因组中的转基因很容易被沉默，而且无论有无沉默诱导子，沉默状态都可以遗传[24]。而内源编码基因只有在诱导子存在的情况下才能被沉默，而且沉默效率远远低于转基因[49-50]。这一特点暗示：尽管存在诱导因子 (24 nt siRNA)，RdDM途径也不大可能作用于内源编码基因。

3 RNA沉默的传递

在植物中，沉默只有向起始细胞以外传递，才能更有效地抑制靶基因表达[51-52]。沉默的传递包含3个层面：沉默信号的扩增、传递和接收。

现已证明：双链siRNA是RNA沉默的信号之一[53-54]。DCL3或DCL4生成的siRNA通过胞间连丝在细胞间运动；通过韧皮部进行长距离运输，形成系统性沉默。运动的 21 nt siRNA 与AGO1结合，介导PTGS[6,53,55]；而运动的24 nt siRNA可能与AGO4、AGO6或AGO9结合，介导DNA甲基化或与转录基因沉默相关的染色质修饰[43,45]。两种小RNA在信号接收组织中都可能利用RNA聚合酶Pol IV或RDR的功能，起始信号的扩增过程[56-57]。然而，目前还不能排除siRNA前体RNA，例如dsRNA作为信号的可能。

一般情况下，初级小RNA对靶基因转录本的积累仅具有微调作用，例如大部分miRNA与靶 mRNA的关系；若要得到更强的沉默效果，有赖于次级siRNA的合成，即信号的扩增过程。次级siRNA分为两类，一类是与原始激发子，如dsRNA相关的siRNA的再生产；另一类来自于原始靶标区段的两侧 (此现象即所谓的“沉默的漂移”)。二者的生成均需要 RDR6的功能和靶标基因的转录[58-60]。而在 TGS过程中，信号扩增伴随着次级24 nt siRNA的产生和启动子区甲基化的扩展，这一过程是通过依赖于 Pol IV-RDR2-DCL3的RdDM途径逐步完成的。在RdDM途径突变体rdr2，nrpd1 (NRPD1是Pol IV的大亚基)和dcl3中，次级siRNA消失，DNA甲基化水平明显下降。Daxinger等在其所使用的外源转基因 TGS沉默系统中还发现：甲基化的扩展是从靶点区向下游单向延伸的[61]。

除了信号的扩增和传递过程，植物内源可能还存在一个信号接收系统，以便更好地协调整个沉默过程。在外源转基因GFP沉默系统中发现：RdDM途径的重要元件NRPD1、RDR2和DCL3以及RDR6可能参与长距离mRNA沉默的信号接收过程[56]。

4 植物内源编码基因RNA沉默的研究

在自然状态下，植物利用miRNA、ta-siRNA和nat-siRNA等途径，适应不同生理或外界环境的需要，对部分编码基因的活性进行调节。大部分活跃表达的蛋白编码基因不受 PTGS或 TGS沉默途径的调节。当人们利用RNAi手段，向植物中转入外源诱导因子，诱导内源蛋白编码基因沉默时发现：无论诱导PTGS还是TGS，都不能得到预期的效果，更不能产生系统性沉默。内源基因只有置于转基因构建中，作为转基因来表达，方能被有效地沉默[23,48,62]。然而，利用RNA病毒携带启动子区片段，建立针对内源基因的VIGS体系，则沉默效果大大加强[63]。这是因为病毒自身的复制及其在细胞间和系统性的扩散，使沉默诱发子 (启动子区片段) 也同时被不断的扩增，从而增强对内源基因的沉默效应。

由于植物内源基因很难被沉默，而以往的沉默研究大多借助于外源系统，不能完全体现内源编码基因在面对沉默诱导因子时的原初反应。因此，对于植物是通过何种方式调控和避免内源蛋白编码基因的RNA沉默，目前所知甚少。郭惠珊研究员等[64]早期通过一个可诱导的 PDS (Phytoene desaturese) 基因沉默系统 (PDSi，包含有沉默诱发子) 的研究，使这一问题露出了冰山一角。研究发现：在可诱导沉默的植株中，沉默诱发子诱导的内源 PDS基因沉默仅限于局部被诱导的组织和极少量系统叶片，不能传递到整个植株[64]。我们近期将PDSi株系与RdDM途径相关突变体drd1、nrpd2和nrpe1进行杂交，发现在这些基因功能缺失背景下，PDS沉默表型增强。分子遗传学分析结果表明：在野生型 PDSi植株中，siRNA的合成，DNA甲基化及其从转录区向启动子区的传递，这些过程都只发生在外源沉默诱发子结构上，而内源 PDS靶点不受影响。在3个RdDM突变体中，外源沉默诱发子转录本及相应的siRNA大量积累，甲基化水平显著低于野生型PDSi株系。我们的实验结果暗示：植物通过RdDM途径，加强外源沉默诱发子的自我沉默，从而阻止沉默信号的继续产生，有效地抑制了由沉默诱发子诱导的内源靶基因转录本的沉默。我们的研究揭示了植物对编码基因正常表达的一种自我保护机制；同时也解释了利用RNAi手段诱导内源编码基因沉默经常无法达到预期沉默效果这一普遍现象背后的原因。

5 植物中的“自我识别系统”

已有的研究结果表明：尽管与沉默诱发子存在序列同源性，内源功能基因很难被沉默[23]。我们的研究揭示：诱导内源编码基因沉默的低效率，与沉默过程中内源靶标上不能产生次级siRNA和DNA的从头甲基化直接相关[65]。次级siRNA的产生与RDR6等相关，DNA的从头甲基化则依赖于RdDM途径，这两者均不能作用于内源编码基因[6,27,62]。这些现象都表明：植物体内可能存在一种天然的“自我识别系统”，这是植物利用基因沉默系统避免自身被沉默的最基本的保障。无论对于RdDM相关的TGS过程，还是在依赖于RDR6的PTGS扩展过程，“自我识别”都至关重要。然而，迄今为止，人们仍未揭开“植物自我识别系统”的神秘面纱。有研究者认为：这可能与DNA的甲基化水平相关。我们的研究发现：与内源靶基因不同，外源转基因DNA结构有一定程度的甲基化，这可能就是植物识别“自己”或“异己”基因组的重要标志之一[65]。另外，T-DNA本身可能具有与重复序列或病毒相似的DNA区段 (例如，通常所用的35S启动子本身就来源于病毒)；或者其插入位点常常与重复序列相毗邻，导致其更容易被RdDM途径沉默[66]。

简言之，植物利用基因沉默机制维持自身基因组的稳定性，是通过PTGS和TGS途径双管齐下的。对于常规表达的基因，主要通过miRNA、ta-siRNA和nat-siRNA等沉默途径进行微调；对于内源转座子等重复序列，则利用siRNA介导的甲基化途径使其保持低活性状态；对于转基因或病毒等外源DNA或RNA结构，植物一方面通过PTGS降解相关RNA，另一方面利用RdDM途直接造成其转录沉默，从而缓解了其对内源功能基因的PTGS作用。从作用机制上讲，后两者有很多的相似之处。这可能是由于它们具备共同的结构特点，均能被植物的“识别系统”检测出来的缘故。

6 展望

每一种生物都具有特定的基因组，然而，生物基因组是如何在亿万年的遗传与变异中，保持相对稳定呢？RNA沉默现象的发现与研究，为人类认识这一问题提供了一个新的视角。RNA沉默能够抑制外源DNA入侵 (病毒、转基因)[67]；保持内源转座子、重复序列等的低活性[68-69]；在发育过程中调节基因表达[70-71]，是一种重要的基因组免疫机制。

尽管近年来的研究成果丰富了我们对于RNA沉默的知识，然而新的问题不断产生，原有问题仍然存在。例如，PTGS和TGS途径中更多调控元件有待发现；与基因沉默信号传递直接相关的调控因子一直没有找到；在基因组中，什么特征决定了一个位点是否能产生 21~22 nt或24 nt的siRNA？植物内源系统如何识别“自己”和“异己”的DNA分子，从而特异地阻击外源DNA的进攻？

尽管植物如何识别外源 DNA结构尚不清楚，但是利用转基因技术遇到以下现象已经不足为奇了：用来研究基因功能的过量表达转基因结构，处于内源RdDM沉默途径监控之下，其真正的过表达功能难以发挥，常常产生共抑制现象；反之，用于敲除内源基因功能的RNAi构建，其表达也受RdDM途径的抑制，只能在起始部位发挥作用，难以向周围组织传递。而长期以来，人们用以研究基因沉默途径的系统往往与转基因技术有着千丝万缕的联系，所得出的部分结论可能还有待于后人的重新思索和验证。

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