重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的构建和分泌表达

李辉，陈思，马娇颖，戴君，谢光蓉，陈建华

·论著·

重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的构建和分泌表达

李辉，陈思，马娇颖，戴君，谢光蓉，陈建华

目的构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌及其目的蛋白的分泌表达，并对其酶活性进行测定。

芽孢杆菌，枯草； 尿酸氧化酶； 高尿酸血症； 分泌表达

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2012, 7(3):187-190

尿酸氧化酶又称尿酸酶（urate oxidase； uricase，EC 1.7.3.3，UOX），是生物体内嘌呤降解代谢途径中的关键酶，它以分子氧为受体催化尿酸分解生成溶解度高的尿囊素、CO2和 H2O2[1-2]。许多物种体内均发现有尿酸氧化酶，但在鸟类及一些高等灵长类动物（如猿和人类）的体内却缺乏具有功能的尿酸酶，而是以尿酸作为嘌呤代谢的终产物[3-4]。尿酸及其盐类在水中溶解度很低，血液中积累过多会导致高尿酸血症，尿酸在患者体内软组织、关节、器官等处形成结晶而沉积，从而导致痛风等临床症状。

目前使用的降低体内尿酸水平的药物主要分为三类：促进尿酸排泄药、抑制尿酸合成药和尿酸氧化酶[5]。有研究表明，尿酸氧化酶降低体内尿酸水平的幅度和速度远远优于其他药物[6]。随着基因工程技术的发展，工程菌表达尿酸酶能显著提高酶的产量，现在已有多种生物来源的重组尿酸酶得到表达[5, 7]。2010 年 9月，美国 FDA 批准了一种PEG 修饰的猪尿酸酶—— Krystexxa（pegloticase）的上市[8]。但是目前猪尿酸酶主要在大肠杆菌中表达，易于形成包涵体，且在提取时需要破壁、变性、复性等操作，降低了收率，增加了成本，使其工业化潜力及其他更为广泛的研究应用受到了一定的限制。因此，本实验通过将猪尿酸氧化酶基因与nprB 信号肽基因相连，导入穿梭载体 pP43X，在P43 启动子的调控下，首次实现了重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的高效分泌表达[9]。枯草芽孢杆菌是目前公认较为安全的宿主菌之一，且具有良好的合成分泌蛋白的能力。因此，重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌的构建不仅简化了猪尿酸酶的分离提取步骤，同时具有潜在的市场前景和社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌株和质粒 大肠杆菌 DH5α，枯草芽孢杆菌 WB800，重组质粒 pET-22b/pUOX，穿梭载体 pP43X、pP43NMK 均为本实验室保存。

1.1.2试剂 引物由上海英潍捷基生物有限公司合成。限制性内切酶 Xba I、Pst I 与 T4 DNA 连接酶购自加拿大 Fermentas 公司；DNA 凝胶回收试剂盒、重组 Taq DNA 聚合酶、低分子量标准蛋白质购自宝生物工程（大连）有限公司；培养基成分购自英国 Oxoid 公司；其余均为分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1pUOX 基因的获取 从重组猪尿酸酶工程菌 pET-22b/pUOX 中抽提重组质粒 pET-22b/ pUOX，根据 Gene-Bank 公布的猪尿酸氧化酶基因序列合成引物，下游引物 5′ 端设计 Xba I 的酶切位点。

以 pET-22b/pUOX 重组质粒为模板，PCR 扩增获得 pUOX 基因。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 25 个循环；72 ℃ 延伸 7 min，4 ℃ 保存。

1.2.2nprB 信号肽基因与 pUOX 基因相连 根据 nprB 信号肽（signial peptide，SP）基因序列合成引物，上游引物 5′ 端设计PstI 的酶切位点。

PCR 扩增获得 nprB 信号肽基因后，分别将SP 基因与 pUOX 基因用凝胶回收试剂盒进行回收。

分别以回收纯化后的 SP 基因与 pUOX 基因为模板，通过重叠延伸 PCR 使之相连。反应条件为：无引物 PCR，94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃30 s，72 ℃ 1 min，共 5 个循环；72 ℃ 延伸 7 min。反应完成后，加入两端引物，94 ℃ 5 min；94 ℃30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共 25 个循环；72 ℃延伸 7 min，4 ℃ 保存，并回收纯化。

1.2.3重组表达载体 pP43X/pUOX 的构建 将纯化好的目的基因扩增产物 SP/pUOX，用PstI 和XbaI 进行双酶切，同样的方法处理穿梭载体pP43X，再分别凝胶回收纯化。将双酶切后的载体与 PCR 回收产物按一定比例于 16 ℃ 过夜连接，重组质粒 pP43X/pUOX 转化到大肠杆菌 DH5α感受态中，并送上海英骏生物技术有限公司进行测序。将重组工程菌 37 ℃ 培养 12 h 后抽提质粒，并将重组质粒通过化学转化法转化蛋白酶缺陷型枯草芽孢杆菌 WB800[10]，经过含卡那霉素的抗性平板筛选获得阳性克隆。

1.2.4重组枯草芽孢杆菌 pP43X/pUOX 工程菌的分泌表达 挑取重组工程菌单菌落至 30 ml LB液体培养基中，37 ℃ 振荡培养 10 h 后，2％ 接种至发酵培养基中，在转接 12、18、24、30 h 后分别取样收集发酵菌液，5600 ×g离心取上清液，同时以空白宿主枯草芽孢杆菌 WB800 作对照。12％ SDS-PAGE 电泳分析，电泳结束后用考马斯亮蓝R-250 染色 2 h，脱色液脱色 2 ～ 3 h 后观察结果。

1.2.5重组猪尿酸氧化酶活性的测定 将菌株接入 LB 液体培养基中，37 ℃ 摇瓶培养 10 h，转接至发酵培养基中，分泌表达 24 h 后，离心取上清液并稀释于硼酸-硼砂缓冲液（pH 8.4），即为粗酶液。

活性单位的定义和酶活的测定方法参照文献[11]进行。

尿酸酶活力单位（U）定义为：在 37 ℃ 和 pH 8.4 条件下，每分钟转化 1 μmol 尿酸成尿囊素所需要的酶量。

2 结果

2.1 pUOX 基因与 SP 基因扩增产物的鉴定及重组质粒的构建过程

以 pET-22b/pUOX、pP43NMK 重组质粒为模板，采用 PCR 方法分别获得的产物经琼脂糖凝胶电泳后，分别在约 900 bp、100 bp 处有单一且清晰的 DNA条带即为扩增的 pUOX 基因和 SP 基因（图 1），采用重叠延伸 PCR 方法将两基因片段连接后，经琼脂糖凝胶电泳后，在 1000 bp 处有单一且清晰的 DNA条带，与理论大小 1008 bp 相符合（图 2）。将目的基因与载体分别双酶切后，通过 T4 DNA 连接酶相连完成重组质粒的构建。

图1 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物Figure 1 Agarose electrophoresis analysis of PCR product

图2 琼脂糖凝胶电泳检测重叠延伸 PCR 产物Figure 2 Agarose electrophoresis analysis of SOE-PCR product

2.2 重组猪尿酸氧化酶的分泌表达

对重组猪尿酸酶基因工程菌 pP43X/pUOX 发酵条件进行优化，37 ℃ 下，在含尿酸的发酵培养基中诱导目的基因在枯草芽孢杆菌中的分泌表达，同时以空白宿主的发酵表达作对照。结果表明，构建的重组工程菌经诱导后，发酵上清液在分子量为34 kD 处有一条明显的蛋白表达条带，而对照在同一位置无明显条带，这与猪尿酸酶基因序列推测的由 303 个氨基酸残基组成的理论相对分子质量34 kD相符，证明重组猪尿酸酶基因工程菌 pP43X/ pUOX 能够分泌表达目的蛋白。电泳结果如图 3所示。发酵上清中猪尿酸氧化酶活力为 2.322 U/ml。

图3 重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌分泌表达目的蛋白的 SDS-PAGE 电泳图谱Figure 3 Analysis of recombinant urate oxidase produced fromBacillus subtilisWB800 by SDS-PAGE

3 讨论

近年来，随着人类生活水平的不断提高，痛风和高尿酸血症的发病率呈持续上升趋势，曾经被称之为“王之病，病之王”的痛风，再也不是上流社会专属的“富贵病”，而是进入了寻常百姓家[12]，成为了危害人类健康的最为常见的疾病之一。此外，在肿瘤化学治疗过程中，出现肿瘤溶解综合征（tumor lysis syndrome，TLS）[13]，引起新陈代谢紊乱。高尿酸血症及并发症最容易在 TLS 中出现，即细胞大量死亡引起血液中的尿酸浓度升高，导致急性肾功能衰竭。重组尿酸氧化酶已经成为治疗这种继发引起的高尿酸血症的有效药物[14]。

从黄曲霉中直接提取的天然尿酸氧化酶 2001 年 6 月在德国和英国上市，2002 年 7 月 FDA 批准在美国上市，用于治疗和预防具有高危肿瘤溶解综合征的血液恶性肿瘤患者的急性高尿酸血症[15]。但重复使用该酶易诱导产生抗体而降低疗效，而且易过敏，仅适于短期使用。因此，与人同源性较高的猪尿酸酶正受到越来越多的关注。

本研究通过 PCR 方法获得猪尿酸酶基因与nprB 基因扩增产物，并且运用重叠延伸 PCR 的方法使之相连接，选取本实验室构建的高效穿梭载体pP43X，采用化学转化法转化枯草芽孢杆菌蛋白酶缺欠型菌株 WB800 中，实现了重组猪尿酸酶的胞外分泌表达，且酶活与大肠杆菌中表达的重组猪尿酸酶相比略有提高[16]，并未受到枯草芽孢杆菌中蛋白水解酶的影响而导致重组蛋白末端氨基酸降解引起重组蛋白末端不齐降低活性，因此本研究为重组猪尿酸酶的制备提供了一条更为有效、简捷的途径。

[1] Hayashi S, Fujiwara S, Noguchi T. Degradation of uric acid in fish liver peroxisomes. Intraperoxisomal localization of hepatic allantoicase and purification of its peroxisomal membrane-bound form. J Biol Chem, 1989, 264(6):3211-3215.

[2] Alamillo JM, Cárdenas J, Pineda M. Purification and molecular properties of urate oxidase from Chlamydomonas reinhardtii. Biochim Biophys Acta, 1991, 1076(2):203-208.

[3] Terkeltaub R. Update on gout: new therapeutic strategies and options. Nat Rev Rheumatol, 2010, 6(1):30-38.

[4] Oda M, Satta Y, Takenaka O, et al. Loss of urate oxidase activity in hominoids and its evolutionary implications. Mol Biol Evol, 2002, 19(5):640-653.

[5] Li J, Chen Z, Hou L, et al. High-level expression, purification, and characterization of non-tagged Aspergillus flavus urate oxidase in Escherichia coli. Protein Expr Purif, 2006, 49(1):55-59.

[6] Bardin T. Current management of gout in patients unresponsive or allergic to allopurinol. Joint Bone Spine, 2004, 71(6):481-485.

[7] Chen Z, Wang Z, He X, et al. Uricase production by a recombinant Hansenula polymorpha strain harboring Candida utilis uricase gene. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 79(4):545-554.

[8] FDA approves new drug for gout. Mol Cell Pharmacol, 2010, 2(4): 169-171.

[9] Zhang XZ, Cui ZL, Hong Q, et al. High-level expression and secretion of methyl parathion hydrolase in Bacillus subtilis WB800. Appl Envir Microbiol, 2005, 71(7):4101-4103.

[10] Wu SC, Yeung JC, Wong SL, et al. Functional production and characterization of a fibrin-specific single-chain antibody fragment from Bacillus subtilis: effects of molecular chap-erones and a wall-bound protease on antibody fragment production. Appl Environ Microbiol, 2002, 68(7):3261-3269.

[11] Friedman TB, Barker AP. Purification and partial characterization of urate oxidase from Drosophila Melanogaster. Insect Biochem, 1982, 5(12):563-570.

[12] Kamienski M. Gout: not just for the rich and famous! Everyman’s disease. Orthop Nurs, 2003, 22(1):16-20.

[13] Baeksgaard L, Sorensen JB. Acute tumor lysis syndrome in solid tumor--a case report and review of the literature. Cancer Chemother Pharmacol, 2003, 51(3):187-192.

[14] Campara M, Shord SS, Haaf CM. Single-dose rasburicase for tumor lysis syndrome in adults: weight-based approach. J Clin Pharm Ther, 2009, 34(2):207-213.

[15] Liu CY, Sims-McCallum RP, Schiffer CA. A single dose of rasburicase is sufficient for the treatment of hyperuricemia in patients receving chemotherapy. Leuk Res, 2005, 29(4):463-465.

[16] Xue J, Wang WY, Chen JH. Cloning and expression of porcine urate oxidase. J Anhui Agric Univ, 2011, 38(4):592-595. (in Chinese)薛璟, 汪维云, 陈建华. 猪尿酸氧化酶基因的克隆及表达. 安徽农业大学学报, 2011, 38(4):592-595.

Construction of recombinant Bacillus subtilis for secreted expression of the porcine urate oxidase

LI Hui, CHEN Si, MA Jiao-ying, DAI Jun, XIE Guang-rong, CHEN Jian-hua

ObjectiveConstruction of recombinant Bacillus subtilis for secreted expression of the porcine urate oxidase (pUOX).MethodspUOX-encoding gene pUOX was placed under the control of the P43 promoter and Bacillus subtilis signal peptide-encoding sequence. The pUOX was connected with a nprB signal peptide by SOE-PCR, then imported the shuttle vector pP43X. High-level expression and secretion of mature, authentic, and stable pUOX were achieved using the protease-deficient strain B. subtilis WB800 as the host.ResultsSDS-PAGE detected shows a clear protein band of about 34 kD, which is consistent with the expected molecular weight. Determination of enzyme activity of the recombinant protein is 2.322 U/ml.ConclusionsConstruction of recombinant Bacillus subtilis for secreted expression of the porcine urate oxidase is successful. Porcine urate oxisase can be expressed with a high activity.

Bacillus subtilis; Urate oxidase; Hyperuricemia; Secreted expression

CHEN Jian-hua, Email: jhchen@cpu.edu.cn

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2012.03.005

国家自然科学基金（81072560）

210009 南京，中国药科大学生命科学与技术学院

陈建华，Email：jhchen@cpu.edu.cn

2012-03-05

方法从 pET-22b/pUOX 重组质粒上 PCR 获得 pUOX基因，然后通过重叠延伸 PCR 技术将 pUOX 与一段 nprB信号肽基因相连，导入穿梭载体 pP43X，构建重组载体pP43X/pUOX，运用化学转化法转化枯草芽孢杆菌 WB800中。

结果发酵表达后胞外分泌液经 SDS-PAGE 检测，在约34 kD 处有一清晰蛋白条带，这与预期分子量一致。发酵液中该重组蛋白的酶活力达 2.322 U/ml。

结论成功构建重组枯草芽孢杆菌猪尿酸氧化酶基因工程菌，目的蛋白分泌表达并具有较高活性。

Author Affiliations:School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China.

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2012, 7(3):187-190