量子点分子信标的制备及其在核酸检测中的应用

贾沪宁，叶宝芬，严拯宇

（中国药科大学分析化学教研室，江苏 南京 210009）

进展与述评

量子点分子信标的制备及其在核酸检测中的应用

贾沪宁，叶宝芬，严拯宇

（中国药科大学分析化学教研室，江苏 南京 210009）

量子点具有耐光漂白、颜色可调、一元激发/多元发射以及发射光谱窄等特性，故将其应用在分子信标中，必将克服传统有机染料的很多缺点。量子点分子信标不但灵敏度高、光稳定性好，而且可以进行多重检测。本文就近几年来量子点分子信标的发展进行了综述，其中针对量子点的制备系统阐述了可用于制备分子信标的量子点类型、量子点与分子信标连接的方式、量子点分子信标猝灭剂的选择及其表征。同时还详细介绍了量子点分子信标在多重SNP测定、细胞内病毒表达等核酸检测中的应用。

量子点；分子信标；核酸检测；制备

1996年，Tyagi和 Kramer[1]设计了一种可以特异性识别核酸序列的新型荧光探针——分子信标（Molecular Beacon）。这种探针是由寡核苷酸形成的发夹型分子，它包括一个环-茎结构。其中环由与靶分子互补的核酸碱基序列组成，一般有 15～20个碱基；茎为两列互补的碱基序列，一般是 5～7个碱基对。分子信标5＇端带有荧光基团，3＇端带有猝灭基团。没有靶分子时，分子信标的荧光基团与淬灭基团距离很近，荧光基团不发光；当分子信标与序列互补的靶分子结合时，环与靶序列发生杂交，茎部分被打开，使荧光基团远离淬灭基团，从而恢复荧光。分子信标具有特异性强、可实时检测等优点，得到了很好的发展[2-4]。然而传统的分子信标使用的荧光基团大都为有机荧光染料，其光漂白性和染料颜色的单一性，限制了分子信标更为广泛的应用[5]。

量子点（quantum dots，QDs）又称半导体纳米晶体（semiconductor nanocrystal），是一种由Ⅱ～Ⅵ族（如CdSe、CdTe、CdS、ZnSe等）或Ⅲ～Ⅴ族（如InP、InAs等）元素组成，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米粒子[6]。量子点一般直径为1～10 nm，由于限域效应，其原有的连续能带结构发生分立、量子化，从而使其物理、化学及光学性质都产生了明显的变化[6]。荧光量子点因其独特的抗光降解、颜色可变、一元激发/多元发射及发射波长可调等特性，可以弥补有机染料修饰的传统探针的一些缺陷，所以被用来设计新型的分子信标[7-9]。本文作者就将对量子点分子信标的制备及其在核酸检测中的应用，尤其是近几年的进展进行介绍。

1 量子点分子信标的制备

1.1 用于制备分子信标量子点的类型

在分子信标中可以作为能量转移信号供体的量子点一般为CdTe量子点[10-12]和ZnS-CdSe核壳量子点[13-14]。在密闭体系中，用高纯氮气脱氧、保护，用巯基乙酸（TGA）作稳定剂，用1 mol/L NaOH调节pH值，得到量子点前体溶液；加入新制备好的NaHTe到前体溶液中；在96 ℃水浴中回流2 h，即可得到尺度均一的水溶性CdTe[10]。ZnS-CdSe核壳量子点最早由Hines等报道[15]，由于量子点表面包覆一层 ZnS显著提高了量子点的量子产率。Dabbousi等[16]在此基础上，将其制备好的单分散的CdSe纳米颗粒表面包覆了一层ZnS，将其量子产率提高到30%～50%。这些量子点具有水溶性较好、制备方法成熟、性质稳定的特点，是制备量子点分子信标的常用材料。

然而在比较苛刻的条件中（如pH值较低时），这些普通的量子点会变得不稳定而影响其检测效果。针对这一问题，研制了硅包裹量子点的分子信标[17]。通过将传统方法制备的三辛基氧膦修饰的ZnS-CdSe量子点与巯基乙醇反应得到羟基修饰的量子点。纯化后再与氨丙基三甲氧基硅烷反应得到氨基修饰的硅烷化量子点。将此产物进一步与琥珀酰酐反应便得到了羧基修饰的硅烷化量子点。与其它的硅量子点相比，它不但耐酸耐盐，水溶性好，而且制备方法简单，不易聚集，更主要的是制成的量子点硅层薄，粒径小，Förster 距离合适，有利于能量转移的形成，对于制备分子信标十分有益。

另外还有研究报道以 Fe3O4为核层原料，以CdTe 量子点为壳层原料合成了 Fe3O4/CdTe 亲水性磁性量子点[18]。再以Fe3O4/CdTe 作为能量供体、3′端修饰有淬灭剂BHQ-2的单链DNA作为能量受体合成分子信标，成功构建了荧光共振能量转移体系。用此方法所制备的探针可利用磁铁将其与游离的DNA、BHQ-2 进行快速分离。分子信标中大多采用单光子-能量转移，这种模式在生物检测中，会受到其自身生物发光的干扰，背景较高。另外由于能量转移中，很难有供体和受体的激发窗口完全不重合，所以直接激发供体时，受体常常也会被激发从而出现假阳性。针对这样的问题研究者们设计了双光子-能量转移。它可以在近红外区域被激发，从而克服了以上的问题。此技术也被应用到了量子点分子信标技术中[19]。以水溶性ZnS-CdSe量子点为供体，以罗丹明染料（ROX）为受体制成的分子信标，在波长为800 nm的近红外光区被激发时，不但避免了受体被激发也消除了生物体中自发荧光的干扰。

1.2 量子点与分子信标DNA链的连接

在量子点分子信标中最常用的连接方式是将羧基修饰的量子点与氨基修饰带有猝灭基团的分子信标 DNA链用交联剂 1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚氨盐酸盐（EDC）连接[12，20-21]。此方法容易操作，但由于反应过程中需多步纯化，使得连接产物稳定性降低。另外连接到量子点上的生物分子的数量也不容易控制。因此有研究采用了链亲和素修饰的量子点与生物素修饰带有猝灭基团的分子信标DNA链的连接方法制备了量子点分子信标[22]。这种连接方式具有很高的结合效率，并且热稳定性很好。Cady等[23]将这两种连接方式进行比较后发现羧基连接的分子信标与目标信号杂交后，荧光信号恢复得更多。这是由于羧基连接分子信标中量子点和猝灭基团距离较小，能量转移较强，猝灭得较彻底。进而与互补DNA杂交后信号强度增大的就相对较多。除此以外，还有报道Medintz 等[24]利用一个具有巯基活性的组氨酸（6）连接片断将量子点连接到分子信标上。合成的组氨酸连接片断纯化后一端通过双硫键与5′端巯基化的分子信标DNA片段连接，另一端则通过金属-组氨酸之间的作用自组装到CdSe-ZnS核壳量子点上。这种自组装的连接方式不但有很高的连接亲和性而且可以控制连接的量子点上的DNA的量。以上说明，好的连接方式需具有组装方便、产物稳定以及可控的生物结合效价的特点。

1.3 猝灭剂的选择

作为猝灭剂，基本要求是其吸收光谱要与能量转移供体的发射光谱重合。由于二甲氨基偶氮苯甲酰（DABSYL）和黑洞猝灭剂（BHQ-2）对多种发射光谱不同的荧光基团都有很好的淬灭作用，成为分子信标通用的淬灭基团[25-26]。在量子点分子信标中，也经常使用这两种猝灭基团[13，22，27]。此外也有报道采用Iowa black FQ作为量子点的能量转移受体[17，23]。研究发现Iowa black标记的分子信标在与互补的 DNA链杂交后，荧光强度的恢复是DABSYL标记的分子信标的2倍。相比与这些有机染料，有很多研究发现纳米金的猝灭效率更高，几乎能接近 100%[22，28-31]。用纳米金作为量子点分子信标的猝灭基团，不但猝灭效果好，而且可以延长在活细胞和动物体内的检测时间[14，23]。此外，由于纳米金吸收光谱较宽可以作为各种发射波长的QDs的通用受体，构成理想的2D-A、3D-A 的FRET 体系，应用于多组分分析[32-33]。Dong等[34]利用石墨烯作为量子点分子信标的猝灭剂成功的检测了目标DNA。实验中没有目标DNA时，分子信标 DNA链与石墨烯的作用使得链上的量子点与石墨烯距离很近，因而被猝灭。当有目标DNA时，分子信标DNA链与之杂交形成双链后从石墨烯上释放出来，这时量子点远离石墨烯，从而荧光得到恢复。这种新方法不但检测灵敏度和特异性很高，而且无需在分子信标上标记猝灭基团，减少了工作量。

1.4 量子点分子信标的表征

在分子信标探针中，猝灭效率是一个重要的参数，它可以用E=）来表示（R0为Förster距离，即猝灭效率为50%时的距离，R为供体和受体之间的距离）[35]，也可用荧光剂的荧光发射光谱与淬灭剂的紫外吸收光谱的重叠范围来直观地表示[20]。在量子点分子信标的制备中一般都会对此进行考察[11，13，20，22]。此外，量子点分子信标的性能还可以通过将其与完全互补、单碱基错配及完全不互补的DNA序列进行杂交后荧光强度的恢复来考察它的特异性[13，22]。完全互补时，荧光信号最强；存在单碱基错配和完全不互补的目标序列时，分子信标的荧光信号则应不能完全恢复。

文献中也有利用凝胶电泳对合成的产物进行表征[10，21]。由于在相同的电泳时间内，电泳速率不同，分子信标单链 DNA＞量子点分子信标＞量子点，故可以将三者区分。进而对合成的量子点分子信标质量进行评价，此法所用仪器简单，利于操作。然而由于使用电泳对分子信标表征还存在重现性不好等的问题，大多数实验中还只是在实验条件优化时利用凝胶电泳进行简单地考察[22，24，36]。

2 在核酸检测中的应用

量子点用于分子信标检测，克服了有机荧光染料的许多不足之处。对于普通的分子信标可以进行的核酸检测工作，如PCR实时检测，单碱基突变检测它都可以完成。此外由于量子点的一些独特性质，量子点分子信标尤其适用于进行多组分同时测定和体内的检测。

2.1 多重SNP检测

通过改变量子点的组成或尺寸，可以使其发射可见光区任一波长的光，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团提供能量，并且保证了供体发射波长与受体吸收波长的良好重叠，增加了共振能量转移，所以量子点分子信标可用于多重SNP检测。Li等[12]利用量子点分子信标和毛细管电泳对两重单碱基突变进行了检测。试验中，针对两个突变位点，分别设计了两种不同颜色的量子点分子信标。当分子信标与单碱基错配的突变型序列杂交反应时，由于杂交反应不能进行，电泳图上只会出现量子点分子信标的信号峰。如果与完全互补的野生型序列杂交反应时，则电泳图上除了量子点分子信标的信号峰还会在迁移时间较短的地方出现分子信标与互补序列杂交产物的信号峰。并且由于分子信标被打开，此峰的信号强度会增大。因此当电泳图上出现4个峰时则两个被测物均为野生型；3个峰则一个被测物为野生型，一个为突变型；2个峰则均为突变型。此方法灵敏度和特异性都很好，另外由于采用了毛细管电泳，可以有效将杂交后的分子信标和没有杂交的分子信标分离，从而避免了假阳性的产生。

2.2 细胞内病毒基因的实时检测

在生物检测中，活体细胞内的基因表达，特别是病毒基因的实时检测得到越来越多的重视和应用。如Jerome等[37]考察了流感、托高土、Borna病的负链RNA病毒在细胞核内外的运输过程，Duprex等[38]利用绿色荧光蛋白研究了麻疹病毒在细胞间的传递过程，以及M cDonald等[39]利用加强绿色荧光蛋白检测HIV在感染细胞内的运输。近年来也有报道利用羧基荧光素标记的分子信标对HAV感染的FRhK-4 细胞的进行检测[40]。在这些众多的检测方法中，分子信标由于特异性高、背景低成为了最有前途的技术。然而传统的分子信标耐光漂白性较差，不利于长时间的监测，其应用也得到了一定限制。相比而言，量子点的荧光强度和耐光降解都大大增加（大约100倍），从而更加有利于活细胞内的病毒检测[41]。Yeh等[14]利用量子点-纳米金分子信标检测了布法罗绿猴肾细胞中科萨基病毒。实验中不但对病毒进行了定量分析，还在荧光显微镜下对病毒的复制做了实时的监测。实验显示，在细胞被病毒感染1 h后即观测到量子点的荧光信号。随着时间的推移，荧光信号越来越强，表明病毒RNA正在不断的合成和聚集。从6 h后直到12 h，量子点荧光信号进一步的向外扩散，正显示了子代病毒对细胞的再度感染。由此，量子点分子信标的应用有利于对病毒寄主的相互作用和发病机理的进一步研究。

2.3 细菌内基因的检测

量子点分子信标由于灵敏度高、特异性好，还可用于微小的细菌内的检测。有研究报道采用量子点分子信标原位杂交的方法对大肠杆菌中β-内酰胺酶耐药基因进行了检测[27]。与之前工作中传统的原位杂交方法相比[42]，由于分子信标在无目标 DNA时不会打开其茎环结构，因此即使在细菌细胞膜甚至在细胞质中存有分子信标探针也不会产生假阳性信号。同时由于分子信标与目的基因杂交后无需进行洗脱等繁琐步骤，从而实现了一步原位杂交检测法。另外量子点分子信标在对目的pUC18基因的特异性结合和背景噪声的消除中都显示出了很大的优越性。因此量子点分子信标将有望成为耐药菌检测的有效生物探针。

3 结 语

分子信标特异性高且无需分离，在核酸检测中有着很广泛的应用。然而其荧光效率却受限于其闭合形式时不能完全猝灭；打开形式时只有一个荧光基团的发光信号。因此研究者们研究了很多方法来提高其信噪比。如设计in-stem 分子信标[43]、引入多个荧光或猝灭基团[44]或利用共轭聚合物作为发光基团[45]以及采用受激准分子发射[46-47]、电化学发光[48]等方法。量子点具有荧光强度高的特点，使用在分子信标中与靶分子结合后，体系中荧光增强的倍数比传统荧光试剂要高，所以检测灵敏度也显著提高[31]。此外，用量子点制备分子信标还具有抗光漂白、可多重检测等优点。相信随着各种新型量子点的出现以及连接、猝灭方式的优化，量子点分子信标必将在基因和医学检测方面有更多的应用。

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Preparation of quantum dot-molecular beacon and its application in nucleic acid detection

JIA Huning，YE Baofen，YAN Zhengyu
（Department of Analytical Chem istry，China Pharmaceutical University，Nanjing 210009，Jiangsu，China）

Quantum dots（QDs） have substantial advantages over organic dyes，including high stability against photobleaching，tunable colors by changing particle size，a single wavelength for simultaneous excitation of different-sized QDs and narrow emission peaks. Replacing the organic fluorophores of the conventional molecular beacon w ith QDs w ill overcome its many shortcomings. Quantum dot-molecular beacon is not only sensitive in measurement and stable against photo degradation，but also can be applied for multi-detection. In this paper，the development of quantum dot-molecular beacon in recent years is introduced. The types of MBs，linkage strategies，fluorescence quenchers and the characterization of quantum dot-molecular beacon were summarized. Moreover，its applications on nucleic-acid diagnostics are discussed，including multiple SNP detection，real-time monitoring on the living cells.

quantum dots；molecular beacon；nucleic acid detection；preparation

TB 3

A

1000–6613（2012）05–1071–05

2011-10-25；修改稿日期：2011-11-28。

中国药科大学青年教师基金。

贾沪宁（1978—），女，讲师。E-mail jiahuning@sina.com。联系人：严拯宇，教授，博士生导师。